精子形态对年轻女性新鲜单囊胚移植助孕结局的影响

吴燕虹 龚超超 习海涛 赵军招

近年来，不孕不育症已成为全球性的问题。不孕不育症发病率约为10%～15%，发病原因中男性因素占40%[1]。常规精液分析的重要指标精子形态正常率能否预测男性生育能力和体外受精胚胎移植结局一直备受争议[2]。有研究表明，精子畸形率高不仅会降低受精率，还会延长自然受孕时间，甚至增加自然流产的概率[3-4]。但也有研究发现即使精子形态正常率为0也有成功受精和受孕的可能，精子形态异常对辅助生殖技术的助孕结局无明显影响[5-6]。目前关于精子形态对单囊胚移植的影响相关报道较少。鉴于单囊胚移植是今后辅助生殖技术革新的方向，本研究通过探讨精子形态对年轻女性患者行新鲜单囊胚移植后助孕结局的影响，以期为提高单囊胚移植的安全性提供临床依据。

1 对象和方法

1.1 对象 回顾性分析2019年1至12月在温州医科大学附属第二医院生殖医学中心行新鲜单囊胚移植的年轻女性患者690例。纳入标准：（1）女方年龄≤35岁；（2）促排卵方案为卵泡期超长方案；（3）女方基础激素水平正常；（4）女方不孕原因为输卵管因素或多囊卵巢综合征，超声提示双卵巢、子宫正常；（5）男女双方身体健康，无酗酒、吸毒等不良嗜好；（6）取卵和移植周期均为第1次。排除标准：（1）不适合新鲜周期移植者，如子宫腺肌症、子宫肌瘤压迫内膜、宫腔粘连、子宫内膜息肉等；（2）男性少弱精子症；（3）男性精子DNA 碎片率高（DNA-fragmetation-index，DFI≥25%）。根据《WHO人类精液检查与处理实验室手册》（第5版）精子形态正常率参考值下限为 4%[7]，将患者根据男方精子形态正常率分为正常组、精子轻中度畸形组和精子重度畸形组3组。正常组：精子形态正常率≥4%，共157例；精子轻中度畸形组：2%≤精子形态正常率＜4%，共256例；精子重度畸形组：精子形态正常率＜2%，共277例。本研究经医院医学伦理委员会审批通过，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 降调节 于月经周期1～5 d注射3.75 mg长效醋酸亮丙瑞林微球（商品名：贝依，规格：3.75 mg/支，丽珠医药集团股份有限公司）降调节，32～38 d后测定血卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、促黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、雌二醇（estradiol，E2），同时B超监测内膜、卵泡的数量及大小。当垂体达到脱敏状态（FSH＜5 mIU/ml、LH＜5 mIU/ml、E2＜50 pg/ml，B超监测无直径＞10 mm卵泡、子宫内膜厚度＜5 mm），则使用促性腺激素（gonadotropin，Gn）启动促排卵。如降调节后B超检查提示子宫内膜厚度≥5 mm，查尿妊娠试验，排除妊娠后再用Gn促排卵。

1.2.2 促排卵 根据患者年龄、体重、窦卵泡数、基础FSH选择Gn促排卵，Gn刺激第5～6天开始监测，根据B超监测及血清性激素水平调整Gn种类和剂量。当有2～3个卵泡直径≥18 mm时，于21:00至22:00肌肉注射注射用绒促性素（规格：5 000 IU/支，丽珠医药集团股份有限公司）4 000～10 000 IU或皮下注射重组人绒毛膜促性腺激素注射液（商品名：艾泽，规格：250 μg/支，瑞士默克雪兰诺公司）125～250 μg 扳机。

1.2.3 取卵、精液检查、移植及黄体支持 扳机后36～38 h，在阴道超声引导下经阴道取卵。取卵当日，男方以手淫法收集精液。获取的卵母细胞常规行体外受精（in vitro fertilization，IVF）操作及胚胎培养，若常规受精失败，则行补救性卵胞浆内单精子显微注射技术（rescue intracytoplasmic sperm injection，R-ICSI）。采用Gardner囊胚分级法进行分级[8]：以数字1～6对囊胚的扩张度和孵化状态进行评分，以字母A、B、C对内细胞团（inner cell mass，ICM）和滋养外胚层细胞（trophectoderm，TE）进行评分。优质囊胚的标准定义为3期及3期以上、ICM及TE均为B级及以上者，可利用胚胎定义为3期以上、ICM和TE评分不同时为C者。取卵后第5天选取1枚优质囊胚进行移植，如本周期内无优质囊胚者，则选取1枚可利用囊胚进行移植。移植后黄体支持方案为：自取卵日起，地屈孕酮片（商品名：达芙通，规格：10 mg/片，荷兰Abbott Healthcare Products B.V.）20 mg/次，2 次/d 口服；黄体酮软胶囊（商品名：安琪坦，规格：0.1 g/片，法国法杏制药厂），0.2 g/次，2次/d口服或阴道给药。

1.2.4 妊娠结局判定标准 胚胎移植后2周，测血清人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）水平以确定是否妊娠。胚胎移植后4周，阴道超声检查发现有孕囊者为临床妊娠；血hCG≥15 mIU/ml或尿妊娠试验阳性，但阴道超声检查未见孕囊者为生化妊娠；发生在妊娠12周前的流产为早期流产，而发生在12周或之后的流产为晚期流产。妊娠满28周至不足37周间分娩者为早产。出生体重＜2 500 g的婴儿为低出生体重儿，出生体重≥4 000 g的婴儿为巨大儿。

1.3 观察指标 助孕结局包括实验室结局、妊娠结局和新生儿结局。其中实验室结局包括获卵数、成熟数、受精数、囊胚形成率、优质囊胚形成率、优质囊胚移植比和囊胚冷冻数等指标，妊娠结局包括hCG阳性率、临床妊娠率、生化妊娠率、早期和晚期流产率、异位妊娠率、多胎妊娠率、早产率、活产率等指标。新生儿结局包括新生儿出生体重、巨大儿和低出生体重儿占比、新生儿死亡率、新生儿畸形率和新生儿性别等指标。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，3组间比较采用单因素方差分析；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，3组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。计数资料组间比较采用χ2检验和Fisher确切概率法。采用多因素logistic回归分析影响活产的因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组患者基本情况比较 3组患者女方年龄、不孕年限、BMI、双侧窦卵泡计数（antral follicl ecount，AFC）、不孕类型、不孕原因、基础激素水平、降调节后激素水平、hCG日激素水平及子宫内膜厚度、Gn用量和天数，男方年龄、不育类型、精液量、精子密度及精子活率等一般情况比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），3组患者精子形态正常率比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表 1。

表1 3组患者基本情况比较

2.2 3组患者实验室结局比较 3组患者获卵数、受精方式、成熟数、受精数、囊胚形成率、优质囊胚形成率、优质囊胚移植比和囊胚冷冻数比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表2 3组患者实验室结局比较

2.3 3组患者妊娠结局和新生儿结局比较 3组患者hCG阳性率、临床妊娠率、生化妊娠率、早期和晚期流产率、异位妊娠率、多胎妊娠率、早产率、活产率、新生儿出生体重、巨大儿和低出生体重儿占比、新生儿死亡率、新生儿畸形率和新生儿性别比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表3。

表3 3组患者妊娠结局和新生儿结局比较

2.4 影响活产结局的多因素分析 以是否活产作为因变量，以精子形态是否正常、女方不孕类型、男方不孕类型、多囊卵巢综合征等18个变量为自变量（赋值情况见表4）进行多因素logistic回归分析，结果显示精子形态异常不是影响活产结局的因素（P＞0.05），见表5。

表4 自变量赋值

表5 影响活产结局的多因素分析

3 讨论

现阶段影响辅助生殖技术结局的因素包括男女方年龄、不孕年数、BMI、母体阴道和子宫内膜微生物组以及着床前后血清孕酮水平[9-10]。本研究入选患者的女方年龄不超过35岁、基础激素水平功能正常、均使用卵泡期超长方案促排卵、首次取卵及移植，可有效避免高龄、卵巢功能减退、反复种植失败以及促排卵方案不同可能对研究结果造成的不利影响。在排除上述因素后，着重探讨精子形态异常对新鲜单囊胚移植助孕结局的影响。

目前，精子形态预测辅助生殖技术妊娠结局方面的应用价值在业界尚未达成共识[11]。多位学者发现，单独的畸形精子症对IVF辅助生育妊娠结局无显著影响[12-14]。相反，Dubey等[15]发现正常精子形态组的正常胚胎率、种植率、临床妊娠率均高于畸形精子组。本研究中，精子形态对新鲜单囊胚移植后临床妊娠率、活产率等妊娠结局和新生儿结局均无明显影响。究其原因，可能在于精子形态分类、染色制片技术缺乏共识，精子形态正常率的阈值也有可能随着时间的推移而改变，精子畸形对妊娠结局的影响似乎比最初想象的作用要小[13]。另外，本研究采用的精子处理方法是密度梯度离心后再上游法，有研究认为该方法不仅可以减少异倍体的精子和欠成熟的精子比例，富集运动能力高的精子群体，还有益于获得冷冻复苏后顶体完整性高的精子，对改善畸形精子百分比具有一定的优越性，从而降低了精子形态畸形可能产生的影响[16-17]。

畸形精子的顶体功能异常可直接导致IVF受精失败或影响受精率[14，18-19]。R-ICSI作为常规IVF受精失败时的一种安全有效的补救方法，从提出发展到如今，已被广泛应用。Li等[20]探讨了精子形态对R-ICSI周期临床结局和实验室结局并无影响。本研究中，3组分别有5、9、18例患者行R-ICSI操作，单纯精子形态异常并未影响受精率，且与囊胚形成率、优胚率以及囊胚冷冻数无相关性。这也意味着精子形态对IVF受精结果的影响尚无定论，孤立的精子形态异常不应作为行ICSI操作的预测因素，倘若IVF过程中发生受精失败，及时行补救ICSI治疗也可获得满意的实验室结局。

流产同样为辅助生殖技术治疗的一个重要风险事件。既往针对流产的研究主要集中在女性方面[21]，对有男性因素导致的流产重视程度远远不够。随着近来研究的进一步深入，发现卵子质量对成功活产的贡献为70%～80%，子宫条件所占的权重为10%～15%，剩余的10%～15%为精子的贡献，当精子异常时，男方因素对于可否获得活产后代的影响显著增大[22]。Gil-Villa等[23]的研究显示，与正常可育男性相比，反复流产患者的男性伴侣有较低的精子正常形态率。本研究中，异常的精子形态不增加生化妊娠、早期流产以及晚期流产等风险的发生，与多位学者的研究[14，24]一致。目前针对精子因素所致流产的研究仍处于探索阶段，胚胎学家们更认可精子DNA损伤（高DFI值）对胚胎发育的影响[25]，临床上应结合多项检查结果综合评估精子质量。

本研究有3个主要局限性，希望能在未来的研究中加以解决。首先，WHO发布的《WHO精液检查与处理实验室手册》（第5版）并没有包括关于中国人群的任何数据和资料，因此，目前正常精子形态的设定是否适合中国人群是很值得探讨的问题。其次，仅仅统计到新鲜单囊胚移植周期妊娠结局，没有进行累计妊娠率统计，且未能追踪新生儿出生后的智力体格发育等情况。最后，系单中心的回顾性研究，日后还需要进行大样本量的、严格控制外变量的、多中心的、前瞻性的随机对照研究精子形态对单囊胚新鲜移植的影响。

综上所述，在年轻女性行新鲜单囊胚移植周期中，精子形态异常既不影响IVF的实验室结局，也不影响妊娠结局和新生儿结局，为精子形态异常患者选择新鲜单囊胚移植助孕的安全性提供一定的参考价值，减少了畸形精子症患者行辅助生殖技术助孕的后顾之忧。