细胞外囊泡在肺部疾病诊断中的应用

杨晟楠，张 力(综述)，石 瑜，赵 勇*(审校)

(1.天津市胸科医院呼吸与危重症医学科，天津 300222；2.天津医科大学总医院呼吸与危重症医学科，天津 300052)

细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是由细胞自然分泌的磷脂双层膜包围并且缺乏功能性核的结构，是多种亚型的集体术语，包括外泌体、微囊泡、微粒、凋亡小体和许多其他名称[1]。外泌体是细胞膜内陷形成的多泡体(multivesicular body，MVB)与细胞膜融合后释放到细胞外空间的膜性囊泡，直径在40～150 nm[2]。微囊泡(microvesicles,MVs)大小不一，直径在100～1 000 nm,从细胞膜出芽脱落[3]。这些纳米大小的囊泡包含蛋白质，脂质，信使RNA(messenger RNA，mRNA)，微小RNA(microRNA)，非编码RNA(lncRNA)和线粒体[4]。对于特定的细胞外囊泡，目前很难确定其具体的生物发生途径，所以本篇综述中将使用国际细胞外囊泡协会推荐的术语EV[5]。EVs由各种不同的细胞类型释放，包括免疫细胞(巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞以及树突状细胞)和结构细胞(内皮细胞、肺泡巨噬细胞、Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞)[6-7]。由于来源的多样性，EVs可以在多种体液中检测到，包括血液、尿液、唾液、母乳、羊水、胸腹水、精液、脑脊液和其他体液[3,8]。此外，在呼出气和支气管肺泡灌洗液中也发现了EV的存在[9-10]。EVs通过其携带的生物活性物质向受体细胞传递复杂的生物信息集从而调节其行为，是细胞间通讯的关键介质[11]。通过这种方式，EVs参与了多种肺部疾病的病理发展和进程，并且在疾病状态下释放的EVs数量、类型和携带物质是不同的，这表明EVs具有作为诊断和预后的新型生物标志物的潜力。

1 EVs的内容物

通过各种高通量测序分析平台，可以深入了解了EVs携带的分子内容。由于这些技术需要大量的EVs，因此大多数分析研究都是基于细胞系分泌的EVs进行的。ExoCarta(www.exocarta.org)是一个专门用于编目EVs内容物的数据库[12]，目前已确定了超过9 000种不同的蛋白质，3 408种mRNA，2 838种miRNA，1 116种脂质。与细胞RNA片段相比，EV转运的RNAs通常较短(通常<200个核苷酸，但可以延伸至5 kb)。它们主要是非编码RNA(ncRNA)，包括微小RNA(miRNA)、转运RNA(tRNA)、以及长链非编码RNA(lncRNA)和大部分片段化的mRNA[13]。非编码RNA(ncRNA)不编码蛋白质，而是在多种遗传机制中起作用，例如调节RNA的结构，表达和稳定性，以及调节蛋白质的翻译和功能。这些核酸分子存在于EVs中免受核糖核酸酶降解，使其成为强有力的循环生物标志物。近年来，EVs中的ncRNA已成为研究的新焦点。

2 EVs在肺部疾病诊断中的应用

2.1急性肺损伤(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respira-tory distress syndrome，ARDS) ALI/ARDS是一种由肺内或肺外原因导致的复杂的临床异质性综合征。ALI/ARDS病理生理学特征为不受控制的肺泡炎症反应，肺泡-毛细血管屏障功能严重受损，有效通气肺组织减少及肺顺应性下降[14]。目前能够达成共识的有效治疗策略仅限于保护性肺通气，而药物治疗并没有明显降低ARDS的病死率(ARDS的病死率介于34.9%～46.1%之间)[15]。所以当前迫切需要鉴定出一种或几种生物标志物用来监测疾病的活动状态，以便指导临床治疗。Letsiou等[16]研究表明，在ALI的小鼠模型中，内皮细胞来源的微囊泡水平升高。蛋白组学分析显示，血浆和支气管肺泡灌洗液中CD62E阳性的微囊泡较对照组升高。这些内皮细胞微囊泡可能作为ALI的诊断型生物标志物。另一项临床前研究表明，在盐酸诱导的ALI小鼠模型的支气管肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid,BALF)中，可以检测到大量上皮细胞来源的微囊泡。通过q-PCR技术证实在这些微囊泡中miR-17和miR-221水平升高。miR-17/miR-221促进了β1整合蛋白的再循环并通过RAB11介导的途径来促进巨噬细胞募集，最终导致肺部损伤[17]。在高浓度氧诱导的ALI小鼠模型的BALF中，同样可以检测到大量上皮细胞来源的微囊泡，通过q-PCR技术证实在这些微囊泡中miR-320a和miR-221水平升高[18]。故BALF中上皮细胞来源的微囊泡miRNA可以作为ALI早期诊断的潜在生物标志物。在临床方面，一项前瞻性队列研究表明，危重患者血浆中微囊泡水平的升高与ARDS风险的降低独立相关[19]。在另一项临床研究中，共纳入158例ARDS患者，结果显示患者肺泡间隙中存在大量外泌体，BALF中外泌体的水平与患者的氧合指数呈负相关，感染性病因引起ARDS的外泌体水平高于非感染性ARDS患者。但是ARDS患者中外泌体增加的原因尚不清楚，目前尚无法区分是与治疗相关的高氧或本身缺氧所致，并且需要进一步的研究来鉴定外泌体的组成[20]。

2.2特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF) IPF是一种慢性进行性间质性肺疾病，其肺组织学和胸部高分辨率CT特征表现为普通型间质性肺炎[21]。IPF病因尚不明确，发病机制也未完全阐明，目前认为肺泡上皮细胞损伤和异常修复是导致肺纤维化的主要机制[22]。该病预后差，在65岁以上患者中，确诊后的平均生存期仅为3.8年[23]。由于发病原因和发病机制不明，目前的治疗手段以减轻症状、改善患者病情为主，并且在疾病的早期诊断，评估病情进展及判断预后等方面，缺乏有价值的生物标志物。Martin-Medina等[24]研究发现，IPF患者支气管肺泡灌洗液中EVs较非IPF的间质性肺病以及非间质性肺病患者明显增加,增加的EV在IPF中充当信号传导介质(如WNT5A)的载体，促进了疾病的发生发展。Makiguchi等[25]通过microRNA PCR阵列的方法检测博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型发现，血清EV中miR-21-5p在急性炎症期和慢性纤维化期均升高。在同步进行的临床研究中发现IPF患者的血清EV miR-21-5p明显高于健康对照组。该研究还发现，血清EV miR-21-5p水平与6个月肺活量下降速率相关，并且与随后30个月的病死率独立相关。这些结果表明miR-21-5p有可能成为IPF早期诊断及用来判断预后的生物标志物。另外，Njock等[26]研究发现IPF患者与健康对照组相比，痰液中外泌体miRNA含量存在差异，并确定miR-142-3P、miR-33a-5p和Let-7d-5p具有临床意义。这其中miR-142-3P与肺弥散功能呈负相关，从而为IPF的诊断和病情评估提供了新的候选生物标志物。目前关于外泌体在IPF中的研究还非常有限，需要更多的研究来鉴定出用于早期诊断和评价预后的生物标志物。

2.3肺癌 肺癌是世界范围内发病率和病死率最高的恶性肿瘤[27]。由于缺乏有效的早期诊断方法，绝大多数患者在确诊时已处于晚期，5年存活率仅为16%～18%[28]。因此需要寻找一种安全易行且准确率高的检测方法来进行早期诊断。近年来，液体活检由于其侵袭性最小、试剂消耗低和易于使用，已被广泛研究并日益流行[29]，弥补了组织活检的不足，成为精准医学的诊断技术之一[30]。一项回顾性分析表明，血浆外泌体蛋白质组学分析显示，与良性肺结节组相比，恶性肺结节组的纤维蛋白原β链(fibrinogen beta chain,FGB)和纤维蛋白原γ链(fibrinogen gamma chain,FGG)的表达明显升高，并且FGB结合FGG检测确定肺结节性质的灵敏度优于单FGB或FGG检测，上述结果表明FGB和FGG可成为新型的生物标志物用来区分良、恶性肺结节[31]。Zhang等[32]比较了健康受试者和非小细胞肺癌(non-small-cell carcinoma,NSCLC)患者的血清外泌体lncRNA水平，发现外泌体lncRNA MALAT-1在NSCLC患者中高表达，并且MALAT-1的水平与肿瘤的分期及预后呈正相关。该研究进一步通过流式细胞技术检测肺癌细胞Annexin/V的表达，证实了lncRNA MALAT-1可以防止肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤的生长和转移。该研究结果表明，外泌体中的lncRNA MALAT-1可以作为一种非侵袭性的基于血清的肿瘤生物标志物用于NSCLC的诊断和预后。Jin等[33]比较了I期NSCLC患者和健康对照者的血浆外泌体miR谱，发现miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p在腺癌中特异性表达，而miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b在鳞状细胞癌中特异性表达，这表明肿瘤细胞分泌的外泌体miR可以作为肺癌早期诊断的生物标志物。在另一项临床研究中发现，与健康对照组相比，在NSCLC患者的血浆外泌体中有6种差异表达的miR，分别为：miR-17-5p、miR-18a-5p、miR-19a-3p、miR-19b-1-5p、miR-20a-5p、miR-92a-1-5p。将这6种差异表达的miR与三种肿瘤标志物(癌胚抗原CEA、细胞角蛋白19片段CYFRA21-1、鳞状细胞癌抗原SCCA)在两个独立的队列(训练集：100例NSCLC和90例健康对照者；验证集：72例NSCLC和47例健康对照者)中进行进一步验证，结果表明miR-17-5p与CEA、CYFRA21-1、SCCA组成的体外诊断小组，在训练集中ROC曲线下面积为0.860，95%CI：0.802～0.906，敏感度63.0%，特异度93.3%；在验证集中ROC曲线下面积为0.844，95%CI：0.766～0.904，敏感性76.4%，特异性76.6%。这表明miR-17-5p与CEA、CYFRA21-1、SCCA组成的诊断小组对NSCLC的诊断具有重要的临床意义[34]。

2.4肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH) PAH是由肺小动脉原发病变或其他原发疾病导致的肺动脉压力升高，以肺动脉重构和肺血管阻力升高为特征，最终可导致右心功能衰竭甚至死亡[35]。PAH诊断的金标准是右心导管检查，这项侵袭性检查对患者来说具有很大的风险，所以研究人员一直致力于寻找循环中易于获取的生物标志物。虽然心房钠尿肽(BNP或NT-pro BNP)作为评价心室病理生理学变化的指标被广泛应用，但是直到后期损伤发生之前该标志物的变化并不明显。因此需要借助新的生物标志物进行疾病的早期诊断。在一项早期研究中，Amabile等[36]发现PAH患者外周血中外泌体含量明显高于健康对照组。在随后进行的另一项临床研究中，将慢性血栓栓塞性PAH患者与健康对照组相比较，同样发现血浆中外泌体的水平明显升高[37]。但仍需进一步研究以明确这些外泌体中特征性表达的蛋白或核酸。最近的一项研究表明，翻译控制的肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)是一种促增殖和抗凋亡的调节因子，在PAH大鼠模型的肺和血浆外泌体中TCTP明显升高。与动物实验结果一致，与健康对照组相比，特发性PAH患者BOECs(blood outgrowth endothelial cells)释放的外泌体中肿瘤蛋白明显升高，该研究提示外泌体中的TCTP有可能成为PAH的潜在诊断性生物标志物[38]。在评价疾病进展和判断预后等方面，Lipps等[39]研究显示，将慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者与健康对照组比较，通过下一代测序和q-PCR技术来检测血清外泌体中小分子非编码RNA(sncRNA)的差异表达，共鉴定出10种miR和21种piRNA。通过进一步生信分析证实，piRNA DQ593039的表达水平与平均肺动脉压、肺血管阻力、右心室收缩压和NT-pro BNP具有相关性。因此外泌体衍生的piRNA DQ593039可以作为评价PAH病情进展和判断预后的潜在生物标志物。

2.5肺结核 据世卫组织报道结核病已经超过艾滋病成为全球范围内发病率最高的传染病[40]，造成这种局面的主要原因在于难以对结核病患者进行早期诊断，这也使得寻找结核病相关的诊断标志物显得尤为重要。Lyu等[41]研究显示，与健康者相比，结核病患者存在差异表达的血清外泌体miR谱，并且其中一些miR被进一步证实可以在潜伏性结核病感染(latent TB infection,LTBI)中特异性表达，为结核病的早期诊断提供了新的视角。另一项临床研究显示，结核病患者血清外泌体中miR-484、miR-425和miR-96的表达明显升高，并与结核感染程度相关，证实了外泌体中的miR可以作为评价病情的潜在指标[42]。Wang等[43]报告了三种EVs携带的miRNAs，包括miR-148a-3p、miR-451a和miR-150-5p在结核病胸腔积液和良性病变胸腔积液间的差异表达。全球结核病的疫情急需快速简便、高敏感性和特异性的新诊断方法，因此将EVs应用于诊断生物标志物的开发是有希望的。

2.6其他 结节病是一种多系统疾病，在表现和预后方面存在异质性。Martinez-Bravo等[44]利用质谱技术对结节病患者BALF中EVs进行了蛋白组学分析，鉴定出690多种蛋白质，包括几种上调的炎症相关蛋白质，为疾病诊断提供了新颖的方法。另一项独立的研究表明，结节病患者的BALF中的EV数量增加，并且差异表达miR-146a和miR-150，其表达与肺功能指数呈负相关[45]。

3 小结与展望

EVs作为细胞间传递信息的载体，其在呼吸系统疾病中的应用已有初步研究。作为纳米级的生物膜结构，EVs能够很好的保护内容物的完整性和生物活性，这些优势极大的提升了EVs在呼吸系统疾病诊断方面应用的可行性。随着精准医学概念的提出，越来越多的人开始关注如何做到疾病的精确诊断和治疗。循环EVs的数量和类型根据肺部疾病的状态而变化，EVs携带的物质，如miRNA、lncRNA等也会随疾病状态而改变，其有望成为肺部疾病的诊断性生物标志物。EVs中含有多种生物活性物质，目前研究多集中于非编码RNA，对于EVs的蛋白组学和脂类研究较少，这些内含物对机体的作用有待进一步研究证实。未来还需进一步优化EVs的分离和纯化技术，以便为后续的鉴定和功能研究提供良好的基础。