慢性肾病血管钙化的发病机制研究进展

闻 松，徐正宇(综述)，蔡子怡，刘 巍(审校)

(1.河北医科大学基础医学院临床医学2017级一大班，河北 石家庄 050017；2. 河北医科大学基础医学院临床医学2017级四大班， 河北 石家庄 050017；3.河北医科大学基础医学院病理学教研室，河北 石家庄 050017)

慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)作为全球重要的公共卫生问题，受到了越来越多的关注。各国CKD患病率高达10%～12%，并且患病率随着年龄的增长显著增加[1]。随着研究的深入，众多证据表明，并发心血管疾病是CKD患者死亡的首要危险因素，而血管钙化(vascular calcification，VC)是导致CKD患者并发心血管疾病的主要原因[2]。VC是血管非生理性的钙盐沉积过程，导致动脉弹性下降、收缩压升高、心脏负荷増加，显著提高了心脑血管事件的发病率和病死率。VC是一个主动的高度调控的过程。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)向成骨细胞表型分化并分泌细胞外囊泡作为磷酸钙沉积位点在VC中起着至关重要的作用。随着肾病的进展，出现了一系列调控VC的非传统因素，包括钙磷代谢紊乱、炎症、氧化应激、细胞衰老、脂肪因子等[3]。

1 CKD血管钙化的特点

VC通常被视为动脉粥样硬化的晚期阶段，CKD患者可观察到动脉内膜和中膜钙化，以中膜钙化更为多见。血管中膜钙化也可称为Monckeberg动脉硬化，被认为是非炎性的过程，常发生在老年患者、糖尿病或CKD患者。中膜钙化的特征是动脉壁中弹力层进行性硬化，可使血管弹性减弱、收缩压升高、脉率加快和心室负荷增加，甚至心力衰竭而死亡[4]。以往的观点认为，VC发生发展的主要原因是钙、磷盐在血管壁的被动沉积。而近些年的研究认为VC是一个类似于骨形成主动的、活跃的、可被调控的过程。VSMCs在CKD血管钙化这一过程中居于核心地位。CKD发生发展中，VSMCs在炎症、氧化应激、细胞衰老、自噬及钙磷代谢紊乱等多种因素调控下，可由收缩表型向巨噬细胞、成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等多种表型转变，进而发生凋亡并产生释放凋亡小体和基质囊泡，成为羟基磷灰石晶体沉积的位点；并表达成骨相关蛋白，导致钙调因子失衡，最终引起CKD血管钙化。

2 CKD血管钙化的发生机制

2.1血管平滑肌细胞向成骨细胞表型转化 健康人体组织中，平滑肌具有收缩表型，可表达一系列收缩蛋白，如平滑肌-肌球蛋白重链SM-1和SM-2、α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)、平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha，SM22α)及钙调理蛋白(calponin)等。同时，相比于心肌细胞，平滑肌细胞在一定条件下可转分化为其他表型的细胞，具有表型的可塑性。在CKD、糖尿病、衰老、炎症和各种毒素作用下，平滑肌细胞通过下调上述收缩蛋白并上调Osterix蛋白、相互作用蛋白Msx2(Msx2-interacting nuclear target protein，Msx2)、核心结合因子α1(core binding factor α1，Cbfα1)、SRY-Box 转录因子9(SRY-Box transcription factor 9，Sox9)和Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)等成骨相关转录因子从而去分化或转分化为成骨细胞、软骨细胞[5]，这些转分化的平滑肌细胞可介导血管壁中矿物质的沉积。VSMCs表型转化在CKD血管钙化的发病机制中居于中心环节，有效逆转或延缓VSMCs转分化是减慢VC的关键。

2.2血管内皮间质化(endothelium-mesenchymal transformation，EndMT) EndMT已被揭示为人类多种疾病，包括癌症和心血管疾病的常见原因。在VC中，血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)可以作为成骨前体细胞的额外来源。血管内皮细胞经历EndMT的过程，涉及内皮功能丧失和成纤维细胞样表型的获得，最终形成具有成骨潜能的细胞。EndMT受不同的细胞外生长因子、炎性细胞因子、成纤维细胞生长因子和各种因素(机械应力、缺氧)的调节。骨髓间充质干细胞是与血管再生有关的祖细胞，而白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和肿瘤坏死因子α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)是尿毒症患者骨髓间充质干细胞钙化表型转化的关键诱因，通过下调BMPⅡ型受体(bone morphogenetic proteinreceptor 2，BMPR2)诱导人主动脉内皮细胞EndMT，单独或联合使用这些分子的靶点药物可额外拮抗尿毒症患者血清的促钙化特性。Sánchez-Duffhues等[6]进一步研究指出BMPR2-JNK信号轴是调节炎症诱导的EndMT并促进钙化的关键途径。即便诸多研究证实EndMT在CKD血管钙化中发挥了重要作用，但具体机制仍不清楚，依然有待进一步的研究。

2.3细胞凋亡及基质囊泡的形成 在CKD各种因素刺激下，VSMCs向成骨样细胞分化，同时VSMCs和成骨样细胞发生凋亡，这将促进VC的发生发展。VSMCs和成骨样细胞凋亡或坏死后降解并分泌的基质囊泡和凋亡小体可使钙磷聚集并使其形成羟基磷灰石晶体。羟基磷灰石通过JNK/c-JUN通路诱导VSMCs凋亡以及成骨分化，进而促进血管钙化的发生[7]。线粒体靶向抗氧化剂Mitoquinone通过通过激活Keap1/Nrf2通路，从而增强抗氧化能力，减少细胞凋亡，进而延缓CKD患者血管钙化的进程[8]。Mitoquinone可能是一种有效的预防CKD患者VC的新疗法。维生素K2通过Gas6/AxL/Akt降低VSMCs凋亡从而抑制钙化；而高钙或高磷的环境可诱导VSMCs质膜形成并释放基质囊泡促进钙化。同时基质囊泡具有很强的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性。ALP不仅能破坏VC抑制剂无机焦磷酸盐的结构和活性，并能导致血管内皮功能障碍[9]。此外，ALP与C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)相关，表明ALP与炎症有关。

2.4钙化调节因子失衡 在健康个体中，钙化与抗钙化系统处于平衡状态，因此不易发生VC。众多研究发现，在CKD患者中，骨钙素(bone gla protein，BGP)、骨形态发生蛋白2(bone morphogentic protein-2，BMP-2)、脂质过氧化产物以及ALP等钙化促进因子表达水平升高；而骨形态发生蛋白7(bone morphogentic protein-7，BMP-7)、骨保护素(osteoprotegerin，OPG)、基质Gla蛋白(matrix Gla protein，MGP)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、胎球蛋白A(fetuin-A)以及焦磷酸盐(pyrophosphate，PPi)等钙化抑制因子功能丧失或表达水平下降。

BMP-2不仅能诱导Msx2和脂蛋白受体相关蛋白的表达促进血管钙化，而且可促进VSMCs的成骨样变;而BMP-7通过降低Cbfα-1的活性，抑制VSMCs表型分化，显著抑制血管钙化[10]。骨钙素通过结合羟基磷灰石形成复合体，减少血管壁羟基磷灰石的沉积、增加巨噬细胞对复合体的吞噬和拮抗BMP-2从而抑制血管钙化[11]。因此，钙化与抗钙化系统的失衡是导致VC发生发展的关键因素，其对VC的促进作用可能与包括氧化应激、细胞凋亡、炎症、miRNA以及高血磷在内的多种因素相关，相关机制有待进一步研究。

2.5炎症 CKD患者中普遍存在全身循环中炎症介质低水平存在并持续升高的微炎症状态，IL、CRP、TNF-α以及TGF-β等炎性细胞因子参与CKD血管钙化的调控。

以往研究表明，TGF-β1在钙化的主动脉瓣中表达，并参与VSMCs的成骨样转化Beazley等[12]揭示了TGF-β-Wnt16-Notch信号通路在VSMCs的软骨样细胞转化过程中的重要作用，Wnt16是Notch信号的正向调节因子，而TGF-β激活抑制了Wnt16的表达，进而促进VC的发生发展。盘状结构域受体1(discoidin domain receptor-1，DDR-1)与TGF-β通路互相作用，抑制胞外囊泡释放，进而抑制CKD血管钙化进展。二氧化硫通过下调TGF-β/Smad途径显著改善VC。

在CKD患者中经常观察到CRP升高，而高水平的CRP是与VC的危险因素。CRP能诱导VSMCs的炎症反应，Liu等[13]对48例终末期肾病患者进行研究，发现高水平CRP患者桡动脉钙沉积显著增加，TNF-α和单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)表达增加，并且揭示了炎症通过激活mTORC1通路诱导VSMCs成骨样分化，进而促进终末期肾病VC的进展。此外，CRP可介导氧化应激诱导平滑肌细胞的成骨/软骨细胞样分化，抗氧化剂可抑制CRP诱导的成骨/成软骨信号和钙化。

TNF-α可以通过核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)/Msx2信号通路引起ALP表达增加和活性升高，促进平滑肌细胞的成骨样分化，TNF-α抗体英夫利昔单抗可阻断BMP-2-Msx2-Wnt3a/Wnt7a信号转导通路，显著抑制主动脉钙蓄积。CKD患者的血液中的钙蛋白颗粒(calcium protein particles，CPP)可以诱导TNF-α的表达和释放，并通过其受体TNFR1促进钙化；而siRNA可通过抑制内源性TNF-α/TNFR1的表达则可改善钙化。Zickler等[14]对肾功能衰竭血液透析患者血清研究分析认为，尿毒症患者血清中高水平TNF-α介导AP-1/c-fos信号通路诱导IL-6表达和分泌的显著上调，进而促进VC。

Kurozumi等[15]研究提示，IL-6/STAT3/JMJD2B通路促进Runx2表达上调，导致平滑肌细胞向成骨样细胞分化；使用IL-6受体拮抗剂，则可显著抑制VC的发生发展。IL-8可通过阻断骨桥蛋白的表达促进VC，而无机磷和吲哚硫酸酯等尿毒症毒素会诱导内皮细胞IL-8的表达和分泌。IL-18通过激活ERK1/2/TRPM7信号通路促进β-甘油磷酸酯诱导的VSMCs成骨样分化。IL-37水平与冠状动脉钙化严重程度平行，并且受炎症以及OPG、高敏CRP等细胞因子的调节[16]。

综上所述，慢性炎症是慢性肾病VC的关键环节。在此过程中，各类免疫细胞被体内环境刺激活化并分泌细胞因子。这些细胞因子通过各种受体及信号通路介导VSMCs的成骨分化、凋亡及间充质转化促进钙化，因此抗炎是治疗慢性肾病VC的关键。

2.6氧化应激 越来越多的研究表明，氧化应激在CKD血管钙化的发生发展中发挥着重要作用[17]。多项研究证实狭窄或硬化VC沉积区活性氧(reactive oxygen species,ROS)、H2O2和NADPH氧化酶等表达增高。一些抗氧化剂，如槲皮素、二甲基延胡索酸和迷迭香酸等已被证明可以减轻VC。槲皮素可能通过调节氧化应激和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)/p38MAPK途径对慢性肾衰竭大鼠的VC起到保护作用；二甲基延胡索酸和迷迭香酸通过Nrf2途径，增强机体抗氧化能力，进而改善VC。

Byon等[18]研究揭示了PI3K/AKT/Runx2信号轴在调节H2O2诱导的VC中的关键作用。在VSMCs钙化过程中，AKT信号激活介导了H2O2诱导的Runx2表达水平上调，进而促进VSMCs成骨样化。若对AKT信号通路进行抑制，可观察到Runx2表达下调和VC发生发展受到明显抑制。Zhao等[19]研究提示氧化应激通过激活Src和BMK1诱导VSMCs凋亡。此外，一些研究表明NADPH氧化酶在CKD血管钙化发生发展中也至关重要。相关研究认为，NADPH氧化酶活性增高可以促进钙化促进因子，如OPN、BMP-2、BMP-4等表达增加[20]，使用抗氧化剂siRNA抑制NADPH氧化酶活性，可观察到钙化促进因子，如OPN、Cbfα1mRNA等表达明显减少。Furmanik等[21]研究证实，Ca2+调控的NADPH氧化酶5(NADPH Oxidase 5，NOX5)水平升高导致氧化应激的发生发展以及基质囊泡的释放，促进VC的发生发展。

2.7钙磷代谢紊乱 通常CKD引起的钙磷代谢紊乱在CKD晚期才会出现，主要表现为低血钙和高血磷。CKD患者肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR)降低，磷的排泄减少，导致高磷血症，同时高磷会抑制1,25-(OH)2-D3的产生，加重低钙血症。CKD会伴有肾小管损伤，直接导致1α-羟化酶活性下降，从而导致1,25-(OH)2-D3水平下降，亦可加重低钙血症。研究表明，在GFR下降至60 mL/min时，甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)会大量分泌[22]。血钙通过与甲状旁腺细胞上的钙敏受体(calcium-sensing receptor，CaSR)结合PTH的分泌进行调节。高磷血症和低钙血症导致CKD患者甲状旁腺主细胞增生和分泌旺盛，继发甲状旁腺功能亢进,这被认为是肾磷酸盐排泄过少和1,25-(OH)2-D3缺乏的一种代偿机制[23]。PTH可以下调组蛋白脱乙酰基酶Sirtuin1而诱导细胞凋亡，这提示PTH可能对血管钙化有着直接作用[24]。

钙磷代谢紊乱导致的高磷血症在CKD患者VC中起到重要作用。磷酸盐由钠依赖型磷酸盐(sodium dependent phosphate，NaPi)共转运蛋白介导而进入细胞。高磷会激活Ⅲ型NaPi共转运蛋白PiT-1，促使磷酸盐进入VSMCs，促进VSMCs发生表型转化[25]。血清磷酸盐升高促进血管基质钙化还与生长抑制特异基因6(growth arrest-specific gene 6)的表达下调有关，生长抑制特异基因6的抗凋亡作用通过Bcl2(B-cell lymphoma-2)介导PI3K/Akt途径实现。高磷血症通过增加线粒体ROS的产生促进氧化应激，上调Runx2的表达介导VC。同时，ROS的不断增加介导了VSMCs的凋亡。此外，研究表明，高磷通过促进线粒体超氧阴离子产生引起VSMCs发生自噬;抑制自噬后，可以促进高磷诱导的基质小泡释放，进而加速VC的发生发展[26]。表明高磷诱导VSMCs自噬通过拮抗VSMCs的钙化是抑制VC的重要机制之一。因此，高磷血症通过多条途径介导CKD患者VSMCs的表型改变、凋亡、钙化因子失调以及自噬等，促进血管钙化的发生发展。

除了CKD患者高血磷和低血钙带来的一系列病理改变外，高血钙也是促进动脉钙化的因素，在CKD患者中高血钙的发病病率为1.81%[27]，其与继发性高PTH以及透析有关。高血钙会促进VSMCs释放基质囊泡，并且会加速VSMCs的凋亡。成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factor-23，FGF-23)主要作用是调节血磷水平，可激活肾脏的FGF-23-Klotho复合物，增加尿磷排泄[28]。在CKD患者中，FGF-23的水平随着GFR的下降而升高，1,25-(OH)2-D3缺乏会导致FGF-23的过量表达。同时FGF-23还可降低1,25-(OH)2-D3，降低钙和磷的重吸收，增加钙和磷的排泄，这会进一步加重低钙血症。

迄今为止，许多研究报告了在CKD患者血清和尿液中的Klotho水平，但Klotho与CKD患者血管钙化的关系存在争议。有研究表明，Klotho可以作用于VSMCs，延缓CKD患者发生VC。在CKD早期即可出现血清FGF-23增加和Klotho减少，这对VC起到了正向作用[29]。亦有研究表明，Klotho与年龄相关，但与GFR、血清钙水平或血清磷酸盐水平无关，并且与FGF23相比，它与CKD的结果没有强相关性[30]。同时，Buiten等[31]通过实验指出，在CKD透析患者中，血清Klotho与心血管疾病和动脉钙化没有独立关联。这些研究结论表明Klotho能否作为CKD患者血管钙化的一种标记物还需进一步的实验和探索。

2.8脂肪因子 脂肪因子主要由脂肪组织产生，对糖脂代谢以及炎症反应的调节发挥重要作用。越来越多的证据表明，网膜素、瘦素、脂联素、内脂素、抵抗素、Apelin等众多脂肪因子对VC起促进或抑制作用[32]。

瘦素和内脂素通过激活NF-κB引起的炎症介质途径加速VC。内脂素参与调节IL-6、细胞间黏附分子1和血管细胞黏附分子的表达[33]；瘦素介导OB-Rb/ERK1/2/RANKL-BMP4和OB-Rb/PI3K/Akt/RANKL-BMP4等通路促进VSMCs的成骨细胞分化，并上调了ALP、骨钙素(osteocalcin,OC)、OPN、Runx2等的表达[34]。血清抵抗素水平与斑块内中性粒细胞、巨噬细胞以及基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的含量呈负相关，也可通过抑制ERK2的磷酸化、消除CXC趋化因子配体8(CXC chemokine ligand 8,CXCL8)诱导的中性粒细胞迁移和肌动蛋白聚合减少中性粒细胞斑块浸润,从而促进VC[35]。

与之相反的是，脂联素、网膜素1和Apelin作为抑制VC的脂肪因子，下调ALP的表达，并抑制β-甘油磷酸盐(β-glycerophosphate,β-GP)诱导的VSMCs中Runx2、BMP-2、胶原Ⅰ、骨钙素和矿化基质的形成。脂联素抑制STATS3磷酸化和核转运来减少由β-GP诱导的VSMCs的成骨分化，下调成骨转录因子osterix的表达[36]。Apelin可以在体外通过ERK和PI3-K信号通路抑制VSMC的成骨细胞分化[37]。而网膜素-1通过PI3K/Akt依赖途径抑制NF-κB受体活化因子配体，抑制Runx2和骨钙素的表达以及基质矿化[38]。同时还通过抑制ERK/NF-κB通路，减少TNF-α激活的巨噬细胞中炎症因子的产生，进而抑制血管内皮细胞的炎症反应和凋亡,从而发挥抑制VSMCs增殖以及成骨样分化的作用。

2.9微生物菌群 CKD患者的肠道微生物群显著改变，导致细菌源性尿毒症毒素产生增加,引起肠道上皮屏障破坏，促进毒素进入血液循环。通过对30例未接受透析的终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)患者进行研究，6例(20%)患者血液中检测到细菌DNA。此外，血液中存在细菌DNA患者的CPR和IL-6水平显着高于未检出细菌DNA的患者。这些发现表明，生长过度的细菌从肠道转移到血液中，促进炎症，加剧了CKD的发生发展[39]。

肠-肾轴的提出也进一步揭示了肠道微生物菌群和CKD的关系。高蛋白高脂肪饮食引起的营养不良会导致甲苯基过量产生以及肠道甲酚和吲哚酚硫酸盐累积，破坏肠屏障，增加肠壁通透性，内毒素和尿毒症毒素通过血液循环流入肾脏导致肾脏炎症。在免疫途径中，来自骨髓的免疫细胞遇到营养不良的微生物群，在肠道内过度活化。肠道中产生的炎症细胞、细胞因子和可溶性尿激酶纤溶酶原激活物表面受体(soluble urokinase plasminogen activator surface receptor,suPAR)通过血液循环促进肾脏炎症[40]。目前有五种不同的肠源性尿毒症毒素与CKD的心血管疾病相关：硫酸吲哚酚、吲哚-3-乙酸、对甲氧基硫酸、氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺。肠道炎症和上皮屏障的破坏促进细菌全身易位，导致炎症和白细胞刺激。硫酸吲哚酚和对甲苯基硫酸与3～4期CKD患者炎症标志物水平升高相关，如IL-6和谷胱甘肽过氧化物酶，并且导致机体广泛的氧化应激损伤。硫酸吲哚酚通过介导p44/42丝裂原激活的蛋白激酶途径导致VSMCs增殖[41]，并与不对称二甲基精氨酸共同加剧高血压大鼠主动脉钙化。在CKD患者中FGF-23与硫酸吲哚酚水平呈正相关，支持肠道源性尿毒症毒素与CKD血管钙化之间存在相关性[42]。

3 展 望

CKD并发心血管疾病的患者中普遍存在VC，而炎症、氧化应激、钙磷代谢紊乱、血管内皮间质化、脂肪因子、微生物菌群等因素在VSMCs所致CKD血管钙化中发挥重要作用。根据钙化机制所产生的不同靶点药物，如Klotho、锌剂、镁剂、白藜芦醇等为改善CKD患者血管钙化提供更多的可能，而目前尚未有明确而有效的治疗方式。因此，CKD血管钙化的病理生理机制仍有待进一步的研究，以寻求更多的治疗靶点，改善CKD患者的预后。