外泌体源性miRNA在胰腺癌诊断中的研究现状

任帅 王中秋

南京中医药大学附属医院(江苏省中医院)放射科，南京 210029

【提要】 外泌体是一种包含RNA、DNA片段及蛋白质等多种生物活性物质的纳米级微囊泡，由多泡体与胞膜融合后分泌到细胞外环境中。外泌体内的微小RNA(miRNA)主要参与干细胞的分化、血细胞的生成、器官的形成、肿瘤的发生发展及转移等。外泌体miRNA因其较高的稳定性和易于检测的优点，被认为是具有潜力的生物学检测指标。本文就外泌体miRNA在胰腺癌诊断中的研究现状进行综述。

胰腺癌早期诊断困难、手术切除率低且恶性程度高，患者预后差，5年生存率低于5%[1-2]。在胰腺癌发病初期明确诊断可显著改善患者的预后、提高其生存质量，因此如何进行早期精准诊断成为胰腺癌研究的难点与热点。外泌体是一种包含RNA、DNA及蛋白质等多种生物活性物质的纳米级囊泡[3-4]，在人体内各种体液中分布广泛[5]，任何细胞均可以分泌外泌体。由于外泌体内的微小RNA(microRNA,miRNA)具有稳定性较好且易于检测的优点，被认为是具有潜力的生物学检测指标[6-7]。本文就外泌体miRNA在胰腺癌诊断中的研究现状进行综述。

一、外泌体源性miRNA概念及生物学特征

外泌体是一种由多泡体与胞膜融合后分泌到细胞外环境中的纳米级囊泡[3-4]，直径30～150 nm，密度为1.10～1.21 g/ml，具有来源细胞的胞质和胞膜，含有多种miRNA、mRNA、蛋白质和脂质等成分[8]。外泌体的生成可以简单地概括为细胞内吞产生的小囊泡融合形成核内体，胞质内的生物活性分子进入核内体后形成多泡体；多泡体与胞膜融合并释放到胞外，最终形成外泌体[9-10]。

外泌体内包含多种长链及短链RNA，统称为外泌体源性RNA。其中，miRNA是一种长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA，亦称为外泌体源性miRNA。据报道共有4 934种miRNA存在于不同来源的细胞或组织外泌体中[11]。外泌体源性miRNA是临床上有巨大潜力的生物学检测指标，与蛋白质相比，外泌体源性miRNA更加稳定，可通过包裹在囊泡结构内而逃脱核糖核酸酶的消化；可在一定程度上反映出供体细胞内的分子变化，同时又可作为分泌性信号因子进而影响到受体细胞的变化[12]。肿瘤细胞中高表达的miRNA会被包载在外泌体内，参与肿瘤细胞的增殖转移及耐药性等，因此可作为肿瘤诊断的新型标志物。

与其他来源的miRNA相比，外泌体源性miRNA作为诊断标志物具有以下优势：(1)易于检出，唾液、血液、尿液、乳汁和脑脊液在内的体液中检测到的miRNA大多数来源于外泌体[13]。(2)可与蛋白质结合形成复合物，而部分复合物存在于外泌体内，从而在循环过程中逃脱核糖核酸酶的降解以保持miRNA的活性与稳定性[14]。外泌体内含有丰富的miRNA，且大部分与RNA诱导沉默复合体蛋白结合而存在于外泌体内。Yan等[15]报道，结直肠癌患者血清中分离出的外泌体miRNA生物稳定性更好。

二、外泌体源性miRNA的分离与检测

外泌体的分离有多种方法，如离心法、超滤法、免疫亲和法、聚乙二醇(PEG)-base沉淀法等[16-21]。离心法可分为超速离心法和密度梯度超速离心法，前者是目前提取外泌体最常用的方法，被视作外泌体分离的"金标准"，其优势是单次提取量高，但缺点是耗时、设备昂贵且回收率较低，多次离心操作容易破坏外泌体囊泡的完整性[16-17]。当对外泌体的浓度有较高要求时，可采用密度梯度超速离心，然而其步骤复杂、涉及工作量较大，所需时间较长，不适合于临床上大样本的外泌体分离。超滤法是利用不同截留相对分子质量的超滤膜对样品进行选择性分离，从而获得外泌体，其分离效率取决于样品中悬浮物的大小和分子量。超滤法的优势是操作简便、效率较高，对外泌体的生物活性影响较小，其缺点是有可能阻塞滤孔，影响膜的寿命，导致分离效率的下降，且同样存在纯度不高的问题[17-18]。外泌体富含特定的膜蛋白，如CD9、CD63、ALIX等，免疫亲和法正是通过对外泌体特有的蛋白进行标记来实现外泌体的分离。其优势在于操作简单，可分离得到较高纯度的外泌体，且外泌体的完整形态不受影响，但缺点是效率低，只能分离具有阳性标记的外泌体，且外泌体内含物如RNA、DNA片段或蛋白质等的生物活性容易受到pH值或盐溶液浓度的干扰，不利于下游实验开展[21]。聚乙二醇-base沉淀法的原理是通过与游离水分子的结合，从而使溶解度小的外泌体析出；其缺点是外泌体纯度较低、回收率低，因杂蛋白的存在而容易出现假阳性等[16,19]。

目前，针对外泌体miRNA的研究主要是基于外泌体miRNA的总浓度、定量PCR以及miRNA芯片技术，更多关注提取到的miRNA的表达和定量。目前的研究工作主要集中在miRNA的表达谱分析，对后续生物标志物的开发和验证较少，在诊疗方面的开发应用更少。上述针对外泌体miRNA的检测方法面临外泌体miRNA含量低、样本消耗量高以及需要RNA提取等挑战，精确度与纯度往往影响后期检测的灵敏度和准确性[22]。近年来，越来越多的研究开始聚焦于太赫兹(THz)光谱在核酸构象和功能研究中的应用，但因检测灵敏度低限制了其潜在生物传感应用[23-24]。最近的一项研究应用链置换扩增技术和金属纳米粒子的信号增强，制备了一种偏振无关的THz超材料生物传感器，结果表明，其具有较高灵敏度的miRNA检测能力[25]。因此，基于新型THz超材料的生物传感器在miRNA的检测中具有重要的应用前景。

三、外泌体源性miRNA在胰腺癌诊断中的研究

胰腺癌早期无症状，手术切除率低且恶性度极高，患者预后差。尽管CA19-9被广泛用于临床上胰腺癌的筛查，但其表达水平在某些胰腺良性病变中也会升高[26]，导致其诊断的灵敏度下降。多项研究表明，外泌体miRNA在胰腺癌的诊断、鉴别诊断、治疗反应及预后评估中发挥重要作用[27-30]。一项关于癌症相关的外泌体研究结果显示，较非癌细胞，癌细胞可释放更多的外泌体直接到达肿瘤微环境或循环系统[31]，表明外泌体及其内含物miRNA可作为潜在的筛查生物标志物，为胰腺癌的早期筛查提供帮助[32]。Xu等[28]研究发现，早期胰腺癌患者血清外泌体中的miR-196a和miR-1246表达水平明显升高。Madhavan等[33]研究了循环外泌体内的miRNA与蛋白质联合检测在胰腺癌组与非癌组鉴别中的价值，二者联合后的诊断灵敏度与特异度分别为100%和80%。Lai等[34]运用RT-qPCR法对29例胰腺癌和11例慢性胰腺炎患者血浆中的外泌体miRNA进行分析，发现与慢性胰腺炎比较，胰腺癌患者外泌体内miR-21、miR-30c、miR-10b及miR-181a的表达水平明显升高，而let-7a的表达水平下降。Que等[35]对胰腺癌组(早期胰腺癌9例、晚期胰腺癌13例)与对照组(慢性胰腺炎与壶腹癌各6例、胰腺良性病变7例、健康者8例)患者的血清外泌体miRNA进行分析后发现，与对照组比较，外泌体来源的miR-21与miR-17-5p在胰腺癌组患者血清表达水平明显升高，且miR-17-5p在晚期胰腺癌患者的表达水平明显升高。Goto等[36]研究发现，与22例健康对照者比较，32例胰腺癌、29例胰腺导管内乳头状瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm，IPMN)患者血清外泌体内的miR-191、miR-21、miR-451a表达水平明显升高，提示血清miR-191、miR-21、miR-451a可作为胰腺癌或IPMN的早期诊断及预后生物标志物。另有多项研究表明，与健康对照者相比，胰腺癌患者血清或血浆外泌体内的多个miRNA表达水平发生明显变化，miR-1231表达水平明显下调[37]，miR-196a、miR-1246、miR-21、miR-483-3p、miR-200b、miR-10b表达水平明显上调[28,38-41]。

综上所述，外泌体miRNA在胰腺癌的早期诊断及鉴别诊断中具有重要预测价值。借助外泌体miRNA对胰腺癌的生物学行为进行评价，有助于尽快地帮助医师制定临床治疗方案，对于改善患者预后、提高患者生存质量具有重要价值。

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