离子通道对胰岛β细胞中胰岛素分泌的调控作用

孙慧珍,雷水红,龚妍春,姚丽华*

(1.江西科技师范大学生命科学学院,中国江西 南昌 330013;2.南昌大学第二附属医院内分泌代谢科,中国江西 南昌 330008)

近年来,糖尿病已成为备受人们关注的重大疾病之一。有资料显示,糖尿病与循环系统表现(包括血管功能障碍)高度相关,而血管功能障碍可能影响各种离子通道[1]。此外,胰岛素分泌减少或敏感性降低会导致体内代谢紊乱[2],这也是糖尿病产生的重要原因。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素,由胰岛β细胞分泌[3],可以通过促进肌肉和脂肪组织对葡萄糖的摄取、合成糖原和生成脂肪来增加葡萄糖的消耗[4]。研究表明,胰岛素分泌是一个极其复杂的过程,在这一过程中,胰岛β细胞膜上的离子通道起着重要作用,其中起主要调控作用的是钠离子通道、钾离子通道和钙离子通道。

1 胰岛素的分泌机制

胰岛素是维持机体内血糖稳态的一种重要激素,是治疗糖尿病的主要手段,尤其是对于1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)患者,胰岛素是必需药物[5]。有资料显示,胰岛β细胞对机体的血糖水平较为敏感,当体内血糖水平偏高时,胰岛β细胞可通过分泌胰岛素进入血液循环来促进葡萄糖的利用并抑制糖异生,从而使体内血糖水平降低;当体内血糖水平低下时,胰岛素分泌则受到抑制[6]。

胰岛素的分泌不仅与膜电位变化有关,而且与细胞内Ca2+浓度的变化密切相关,除此之外,动作电位(action potential,AP)的产生对胰岛素分泌也至关重要[7～8]。资料显示,胰岛素的释放依赖于β细胞膜上低亲和力葡萄糖转运体内流的葡萄糖所引发的动作电位,这是β细胞的主要电信号,主要由离子通道的协同激活形成[9～10]。研究发现,当胞外葡萄糖浓度升高时,葡萄糖的快速摄取和随后的糖代谢会导致细胞内ATP增加,ATP/ADP比值的升高使ATP敏感钾离子通道(ATP-sensitive K+channels,KATP)关闭,这一关键通道的关闭会导致膜去极化,细胞兴奋性增加,从而进一步打开电压门控钙离子通道(voltage-gated calcium channel,CaV),增加钙内流,使细胞内Ca2+浓度增加,激活存储胰岛素分泌通路信号,促进胰岛素分泌[11～13]。综上可知,调节离子通道的电活动可以调控胰岛素分泌,离子通道与胰岛素分泌密切相关(图1)。

图1 胰岛素的分泌机制[11～13]Fig.1 The mechanism of insulin secretion[11～13]

2 离子通道与胰岛素分泌

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。具有电活性的胰岛β细胞可以通过分泌胰岛素来调节体内血糖水平,而在胰岛素分泌这一过程中,胰岛β细胞膜上离子通道的活动在刺激-分泌耦联中具有重要作用[9,11],这提示糖尿病的发生可能与某些离子通道的功能缺陷有关。因此,研究胰岛β细胞膜上某些离子通道的特性,有助于人们进一步解析糖尿病发病机制,从而为糖尿病的精准治疗提供重要参考依据。

2.1 钠离子通道对胰岛素分泌的作用

钠离子通道是选择性允许Na+跨膜通过的内向离子通道,其功能是维持细胞膜兴奋性及其传导,主要存在于神经元、内分泌细胞和肌肉细胞等兴奋性细胞中。目前发现的存在于胰岛β细胞中的钠离子通道主要包括电压门控钠离子通道(voltage-gated sodium channel,VGSC)和乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)激活的配体门控钠离子通道[11]。

VGSC在可兴奋性细胞动作电位的产生和传导过程中具有重要作用[14]。关于VGSC功能的直接报道首次出现在20世纪80年代,当时研究人员在RINm5F细胞中发现了一种短暂内向Na+电流,其可以被2.5 mg/mL河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)阻断[15]。后来也有研究证明,TTX可以抑制Na+电流,阻断葡萄糖依赖性线粒体[Ca2+]i升高、线粒体代谢活性和ATP的产生,进而降低葡萄糖刺激的胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion,GSIS)[16～17]。目前,虽然很多研究已经证明VGSC与胰岛素分泌密切相关,但迄今为止,关于钠离子通道在胰岛素分泌过程中的具体作用还存在争议。有研究通过敲除C57Bl6/J小鼠的Scn1b基因发现,胰岛细胞中NaV1.7辅助β1亚基(Scn1b)的遗传缺失会损害GSIS[18]。但另有研究发现,敲除NaV1.3α亚基Scn3a可抑制GSIS,但小鼠的胰岛素分泌不受NaV1.7的影响[19]。而Szabat等[20]发现,敲除NaV1.7(Scn9a)可以显著增加胰岛素含量,即胰岛素分泌与NaV1.7有关。此外,有资料显示,三分之二NaV1.7功能获得性突变的患者也发展为糖尿病[21],这表明VGSC的增加可能导致糖尿病表型,但需要进一步的研究来支持这一结论。

Ach作为迷走神经的递质,具有增加胰岛β细胞释放胰岛素和增强葡萄糖依赖的电活动的作用[22]。陶峰等[22]指出,Ach能通过毒蕈碱受体1(muscarinic receptor 1,M1)的介导增强β细胞电活动,且Ach能激活TTX敏感的钠通道,发生Na+内流而使膜去极化。另外,有资料显示,胰岛上具有胆碱能神经纤维,电刺激迷走神经或服用胆碱能药物可以增强胰岛素释放,在胰岛素释放受到最大葡萄糖刺激的情况下,Ach能使β细胞去极化,并延长动作电位的重复放电周期[23～24]。早期,Gagerman等[23]发现,阿托品可以抑制Ach的电效应,但不能单独抑制葡萄糖的电效应,这提示胆碱能增强胰岛素释放可能是通过改变跨膜离子通道活性实现的。后来有研究表明,Ach可以促进胰岛中Na+的摄取[24]。这些结果都提示,胰岛素分泌可能与Ach激活的配体门控钠离子通道有关。

近年来,我们团队通过全细胞膜片钳技术以及细胞生物学方法对VGSC在胞外血糖调节中的作用进行了系列研究。首先,以INS-1细胞(大鼠胰岛细胞瘤细胞,胰岛素分泌机制研究的常用模式细胞,对葡萄糖具有稳定的强烈响应特性,适合进行生化相关的分子研究,且不会增加表型漂移的复杂性[25])为研究对象,采用胞外不同浓度的血糖刺激研究了VGSC对胞外葡萄糖水平的响应作用,发现胞外血糖浓度的增加可以明显抑制VGSC的活性,且这种抑制作用呈浓度依赖性。同时,我们还发现18 mmol/L葡糖糖部分抑制了VGSC通道活性,但增加了胞内胰岛素的合成水平,表明在INS-1细胞中VGSC活性的改变参与了葡萄糖稳态的调节过程[26]。基于上述研究,我们团队还对马齿苋多糖(polysaccharide isolated from Portulaca oleracea L.,POP)基于VGSC调控INS-1细胞胰岛素分泌的作用进行了研究[27～28]。结果显示,POP在部分降低VGSC活性的同时,可以明显提高INS-1细胞的存活率,促进胰岛素的合成[27]。目前,针对VGSC参于血糖稳态调节的争议主要集中在其活性的改变与胰岛素合成分泌的内在关系。有的研究发现,VGSC活性的增加可以促进胰岛细胞胰岛素的分泌,从而发挥胞外血糖稳态调节的作用[29],而我们团队的上述研究却明确提示,VGSC参与胰岛细胞血糖稳态调节活动与其通道活性的部分抑制密切相关,而且,我们的这一观点也得到了相关研究[30]的支持。针对上述争议,我们分析可能与以下两点因素有关:第一,VGSC活性的改变对细胞活性状态的影响。已有研究发现,VGSC活性的过度激活,导致细胞持续去极化或过度去极化,从而给细胞的健康带来负面影响,并最终影响细胞的胰岛素合成与分泌能力[15,30]。因此,适度降低VGSC活性有助于促进血糖稳态调节活动,很有可能与细胞健康状态的改善相关;第二,VGSC活性的改变与血糖稳态调节活动之间存在其他调控路径的复杂影响。例如:VGSC特异性抑制剂TTX可以抑制线粒体中的胰岛素分泌,阻断葡萄糖依赖性线粒体Ca2+浓度的升高以及线粒体代谢活性和ATP的产生,而线粒体的代谢活性和ATP的产生对于细胞膜与线粒体之间的功能互作至关重要,同时这些相互作用涉及与β细胞中胰岛素分泌相关的Ca2+信号传导[16]。这也提示我们,VGSC还可通过细胞间Ca2+释放调节胰岛素分泌,改变线粒体能量代谢。而我们也通过实验发现,POP在部分抑制VGSC活性的同时,可以提高INS-1细胞内Ca2+浓度和线粒体膜电位,引起细胞膜去极化,促进ATP的合成和胰岛素分泌[28]。除此之外,我们还发现POP可以通过调控NaV1.3和NaV1.7蛋白的表达,调节INS-1细胞胰岛素的分泌与合成[28]。当然,要确切阐明VGSC参于血糖稳态调节的具体机制,开展针对性的离子通道电生理研究与分子生物学研究还是很有必要的。

2.2 钾离子通道对胰岛素分泌的调控

钾离子通道是选择性允许K+跨膜通过的外向离子通道,是目前发现的离子通道中种类最多、存在最广泛且作用最复杂的一类离子通道,其与多种生命活动密切相关,因此在胰岛素的内分泌调控研究中,关于钾离子通道的研究相对较多,且争议也相对较少。大量研究已经表明,胰腺β细胞中钾离子通道在胰岛素分泌中起着关键作用[1,8,31～45],其中KATP、电压门控钾离子通道(voltage-gated K+channels,KV)以及钙激活的钾离子通道(Ca2+-activated K+channels,KCa)是参与胰岛素分泌的几个主要离子通道[15]。

KATP存在于包括大脑、胰腺、平滑肌和骨骼肌在内的多种组织中,被认为是一种代谢传感器,通过控制细胞膜电位将细胞代谢与电活动联系起来,是胰腺β细胞中刺激-分泌耦联的重要组成部分,其介导的K+外流在维持低血糖水平下β细胞的静息电位中起着重要作用,且此时胰岛素分泌只发生在基础水平[5,8]。Alexander等[31]首次描述了KATP通道,该通道对钾具有高度选择性,可以通过响应血浆葡萄糖水平的波动来调节胰岛素分泌,因此是葡萄糖稳态的重要调节器。有研究表明,KATP通道由内向整流Kir6和磺酰脲受体(sulfonylurea receptor,SUR)组成,其中,SUR1受体负责核苷酸结合和核苷酸结合折叠的水解,Kir6.2亚基负责孔的形成和离子选择性。大量资料显示,KATP通道活性抑制剂——磺酰脲类降糖药(sulphonylureas,SU)就是通过与SUR受体或Kir6.2亚基相互作用而发挥作用[32～33]。Koster等[34]研究发现,在小鼠中过度表达ATP不敏感的Kir6.2会导致小鼠出现糖尿病症状;在新生儿糖尿病患者中,Kir6.2和SUR1基因存在突变。另外,有资料显示,Kir6.2的E23K变异与口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT)后血清胰岛素反应受损和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)风险增加相关[35]。除此之外,研究发现,细胞内ATP/ADP比值影响KATP通道活性,血糖浓度升高会影响代谢活动,使细胞内ATP增加,由此产生的ATP/ADP比值升高会使KATP通道关闭,进而导致膜去极化,促进细胞电活动增加,同时细胞内Ca2+增加,引起胰岛素分泌,而在该通道开放情况下,β细胞会发生超极化,使胰岛素分泌受到抑制,所以,KATP通道对ATP/ADP升高的反应性降低会导致胰岛素分泌减少和糖尿病[1,34,36]。

KV是受电压调节的离子通道,是动作电位复极化、钙离子通道关闭和限制胰岛素分泌的潜在介质[37]。有资料显示,KV的循环激活产生向外的“延迟整流”钾电流,钾电流驱动每个脉冲的复极化阶段,这种复极化会使β细胞CaV关闭,从而阻断β细胞CaV所触发的胰岛素分泌[38～39]。胰腺β细胞中有许多不同的KV通道亚基,如:KV1.4、KV1.6、KV2.1和KV3.2[39],其中KV2.1是哺乳动物β细胞中发现的延迟整流电流的主要组成部分,其促进β细胞去极化诱导的胰岛素胞吐作用,并且在β细胞胰岛素分泌爆发期间参与了空腹血糖的维持[39～41]。研究显示,敲除KV2.1基因会使KV电流降低,动作电位的持续时间增加,且在响应葡萄糖刺激时胰岛β细胞能分泌更多胰岛素[41]。另有研究报道,编码KV1.7的基因位于19号染色体(19q13.3)上的一个区域,该区域具有一个糖尿病易感性位点。Finol-Urdaneta等[39]发现conkunitzin-S1可通过降低KV1.7介导的β细胞延迟整流电流来增加GSIS,从而增加动作电位放电和细胞质内的游离钙。其他表达并调控人类β细胞功能的KV通道还包括HERG通道及编码KV11.1和KV11.2的相关基因[21]。KV11.1功能缺失会导致胰岛素分泌增加和低血糖[42],而且,编码KV11.2的KCNH6基因的功能缺失会导致青年成熟型糖尿病[43]。上述成果均为基于KV通道治疗糖尿病的研究提供了可能性。

KCa是同时受Ca2+浓度和膜电压调节的离子通道,其响应细胞内Ca2+浓度的升高而激活,可以调节细胞膜电位与细胞内Ca2+内流的关系,而Ca2+内流是囊泡胞吐的主要决定因素[44]。KCa通道按照其电导大小分为小电导钙激活的钾离子通道(small-conductance Ca2+-activated K+channel,SK)和大电导钙激活的钾离子通道(large-conductance Ca2+-activated K+channel,BK),其中BK通道在调节细胞内新陈代谢和Ca2+的平衡中发挥了重要作用。Braun等[17]研究发现,阻断BK通道可使动作电位振幅增加70%,促进胰岛素分泌,且膜复极化过程需要BK通道参与。随后,也有研究发现,阻断BK通道可使流入β细胞的Ca2+和GSIS增加[45]。以上这些研究都说明,胰岛素分泌与KCa通道有关。

2.3 钙离子通道对胰岛素分泌的调控

钙离子通道是Ca2+在细胞内外以及细胞器和细胞质之间流动的蛋白质复合体[36]。它存在于机体各种组织细胞中,是调节细胞内Ca2+浓度的主要途径。一般认为,膜上主要存在两类钙离子通道,即CaV和受体激活的钙通道。大量研究已经表明,CaV与胰岛素分泌有密切关系[46～51]。

CaV是可兴奋细胞参与多种生理功能所必需的,包括递质释放和激素分泌、兴奋-转录耦合和兴奋-收缩耦合[46],也是β细胞外钙内流的主要通道[7],在胰岛β细胞维持血糖稳态这一过程中具有重要作用。葡萄糖诱发的胰岛素分泌需要细胞外Ca2+的存在,Ca2+通过CaV通道流入胞内触发胰岛素分泌,是该通道调节胰岛β细胞分泌胰岛素的一个重要途径[17]。根据电生理学特点,CaV通道主要包括L、P/Q、N、R和T等几种分型,可能所有类型的CaV通道都参与了胰岛素分泌的调节[38],但L型CaV通道是触发胰岛素分泌所必需的[7,47]。已有资料显示,刺激胰岛素分泌所需的Ca2+浓度的持久变化只能通过缓慢失活的L型Ca2+通道实现,而不能通过快速失活的T型Ca2+通道实现,且在人β细胞中,阻断L型Ca2+通道可完全抑制葡萄糖诱导的动作电位和胰岛素分泌[46]。另外,作为一种旁神经元,β细胞具有多种CaV通道,主要包括CaV1、CaV2和CaV3[48],但在Ca2+触发的胰岛素分泌过程中,CaV1通道亚型起主要作用[39]。位于β细胞上的CaV1通道有两种亚型,即CaV1.2和CaV1.3[48]。研究发现,缺乏CaV1.2亚型的小鼠β细胞CaV通道会使电流降低且胰岛素分泌减少,从而使机体出现糖耐量受损现象[49]。Yang等[50]通过对CaV1通道敲除的小鼠胰腺β细胞进行研究发现,CaV1.2和CaV1.3通道的超极化能使全细胞的CaV通道电流加强,CaV通道的开放率和通道数量增加,且增加胰岛素分泌。另有研究报道,Tdp-43(TARDBP编码的TAR DNA结合蛋白43 kD)缺失通过下调CaV1.2通道来抑制胞吐,从而减少MIN6细胞和TARDBP基因敲除小鼠的早期胰岛素分泌;过表达CaV1.2通道可使TARDBP基因敲除的MIN6细胞恢复早期胰岛素分泌[51]。此外,有研究证明CaV的功能获得性突变会导致高胰岛素血症和低血糖症。例如:与Timothy相关的CaV1.2通道的功能获得性突变会导致间歇性低血糖,这可能是胰岛素分泌增强所致[52];CaV1.3通道的功能获得性突变会导致高胰岛素血症和低血糖[53]。由于增强的CaV激活会导致胰岛素分泌增加,所以可以预测CaV活性降低会减少胰岛素分泌并导致糖尿病的发生[21]。以上这些结果无疑都表明,胰岛素的分泌与CaV1.2通道和CaV1.3通道有着密切关系,所以CaV1.2通道和CaV1.3通道可能可以作为潜在的治疗糖尿病的靶点。

2.4 钠钾钙三种离子通道相互作用对胰岛素分泌的调控

胰岛β细胞功能的发挥和存活依赖于一系列离子事件组成的复杂电信号系统,即Na+、K+、Ca2+等离子的跨细胞膜活动,这些电信号系统可以对β细胞的多种活动进行调控,尤其是GSIS[38]。而在调控胰岛素分泌过程中钠离子通道、钾离子通道和钙离子通道之间是互相作用的。

胰岛素分泌是由Ca2+依赖的动作电位爆发引起的,而β细胞电活动的目标是生成启动胰岛素分泌的信号,即细胞内Ca2+浓度增加[54]。在血浆葡萄糖水平升高的情况下,葡萄糖的摄取、β细胞的代谢被启动,并导致胞质内核苷酸浓度变化,从而使KATP通道关闭,抑制K+外流,引起细胞膜缓慢去极化[55]。当去极化进行到某一临界值,即达到细胞膜的阈电位时,钠离子通道和钙离子通道开放,胞外的Na+、Ca2+内流,使细胞膜进一步去极化,从而刺激胰岛β细胞分泌胰岛素。之后,KV通道开放,产生缓慢激活的K+电流,并以此参与细胞膜复极化阶段,复极化使CaV通道关闭,阻断CaV通道介导的Ca2+内流及其所诱发的胰岛素分泌作用[37,39](图2)。另外,当血糖水平降低时,代谢被抑制,KATP通道打开,开放的KATP通道通过调节葡萄糖浓度和K+外排,维持β细胞膜的负电位,而这个负电位会导致CaV通道关闭,从而抑制β细胞的电活动和胰岛素分泌作用[1,54]。由此可见,胰岛β细胞膜上Na+、K+、Ca2+等离子通道之间的相互影响、相互作用在胞外血糖稳态调节中发挥着不可或缺的重要作用。

图2 钠钾钙3种离子通道相互作用对胰岛素分泌的调控[36～37,39,55]Fig.2 Regulation of insulin secretion by interaction between ion channels[36～37,39,55]

3 离子通道药物在糖尿病临床治疗中的应用

离子通道是一种膜蛋白,参与了细胞众多的生理功能和病理过程。研究发现,多种疾病与离子通道的突变或功能障碍有关,因此,离子通道是多种疾病的重要治疗靶点。迄今为止,有1 300多种药物被批准用于治疗不同类型的疾病,其中13.4%(170～180种)的药物靶向于离子通道[1]。鉴于离子通道与胰岛素的分泌密切相关,很多离子通道抑制剂[32～33,56～60](表1)在糖尿病的临床治疗中发挥着不可或缺的作用。

表1 可用于糖尿病治疗的离子通道抑制剂及其潜在的药物靶点Table 1 Ion channel inhibitors for the treatment of diabetes and their potential drug targets

目前,虽已有大量研究证实,钠钾钙3种离子通道均与胰岛素分泌密切相关,但在糖尿病临床治疗上所使用的药物主要是针对钾离子通道不同亚型的一些离子通道抑制剂,其中应用较为广泛的是SU。SU是临床应用最早、最广泛,种类最多的口服降糖药。SU用于通过饮食、锻炼控制无效,且身体消瘦的2型糖尿病患者。该类药物主要通过KATP通道发挥降糖作用,即KATP通道上的一个特定位置被SU占据,导致KATP通道关闭,随后钙离子通道打开,胞内Ca2+浓度增加,触发胰岛素分泌[61～62]。该类药物有一个共同的分子结构R1-SO4NHCONH-R2,其中R1和R2被不同的基团取代,构成不同的降糖药物[63]。第一代SU(如甲苯磺丁脲、氯黄丙脲)副作用较大,已很少使用,目前临床上常用的SU为二代和三代,如第二代的格列本脲、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮以及第三代的格列美脲。除刺激胰岛细胞释放胰岛素外,磺酰脲类药物还可以降低肝胰岛素清除率,减少胰高血糖素分泌,增强外周组织对胰岛素的敏感性[62,64]。需要指出的是,该类药物的安全性和临床实用性仍需要关注,特别是该类药物使用所带来的一些潜在副作用(如低血糖、体重增加、心血管风险)[61]。

除上述药物之外,天然产物也是离子通道调节剂的重要来源。目前,已有资料显示,天然产物及其活性成分(多糖类、黄酮类、生物碱类、苷类等)在治疗糖尿病方面有显著的疗效且副作用小,其作用机制与多种因素有关,其中包括调控胰岛β细胞膜上的离子通道[36]。有研究发现,文多灵(vindoline,长春花生物碱)可以通过抑制KV2.1通道,降低电压依赖性外向钾电流,促进胰岛素分泌,并且其在抑制KV2.1后,可以使β细胞免受细胞因子诱导的凋亡[65];京尼平苷(geniposide,栀子提取物)不仅作用于KV通道,而且可以激活CaV通道,增强向内的Ca2+电流密度,促进胰岛素分泌[66]。相信,随着离子通道对胰岛素分泌调控机制研究的不断深入,未来可供临床选择的以离子通道为靶点的降糖药物会越来越多。

4 小结与展望

胰岛β细胞的主要生理功能是分泌胰岛素,在维持体内血糖稳态中发挥重要作用,而其在释放胰岛素过程中会发生一系列离子活动,即Na+、K+、Ca2+等离子的跨膜转运。由上所述可知,钾离子通道和钙离子通道是β细胞膜上最活跃的离子通道,也是研究较为深入的离子通道。研究表明,KATP通道介导的K+外流对维持细胞的静息膜电位以及β细胞低水平兴奋性具有重要作用;CaV介导的外钙内流能直接刺激胰岛素分泌颗粒的运输和胞外分泌,是调节β细胞分泌胰岛素的重要途径;而KV通道可以在去极化后缓慢激活并产生向外的“延迟整流”钾电流,介导动作电位的复极化阶段,从而抑制胰岛素的分泌。目前,针对钾通道、钙通道的研究已经较为明朗,但钠离子通道的作用还具有争议性。虽然我们团队的研究结果已经表明钠离子通道活性的改变在胰岛素分泌过程中同样发挥重要调节作用,但具体调控机制仍有待进一步确定,所以接下来我们将继续借助膜片钳技术、分子生物学技术等手段,在已有研究的基础上,对 VGSC 以及 Na+、K+、Ca2+等离子通道参与机体血糖稳态调节的内在联系进行深入研究。相信,人们对离子通道在调控胰岛素分泌方面的深入研究,将有助于进一步解析糖尿病的发病机制,最终为糖尿病的精准治疗提供理论依据。