巨噬细胞移动抑制因子在牛胚胎早期发育中的表达模式及作用初探

王丽君,王勇胜,李 楠,朱虹丽,庞 媛,张 辉*

(1.陕西中医药大学,中国陕西 咸阳 712046;2.陕西中医药大学附属医院,中国陕西 咸阳 712000;3.西北农林科技大学,中国陕西 杨凌 712100)

巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一种在进化中高度保守的蛋白质,具有重要的生物学功能。研究发现,MIF在调控宿主炎症反应和免疫应答[1～2]、细胞增殖和凋亡[3]、细胞氧化还原[4]、肿瘤的生长和新生肿瘤血管的形成中起着重要作用[3,5]。除此之外,MIF还在哺乳类动物生殖系统各器官和母胎界面均有表达[6],参与了生殖过程的多个环节,包括胚胎早期发育、胚胎植入、胎盘发育和妊娠维持[7～11]。

MIF在早期胚胎发育中的作用目前研究较少,已有的研究发现MIF调控蟾蜍胚胎的神经发育[12],调控斑马鱼胚胎组织增殖和分化[13],参与鸡胚晶状体的早期分化[14]。MIF在哺乳动物早期胚胎发育中的作用研究更少,目前相关研究仅在小鼠卵母细胞和胚胎中检测了MIF基因的表达水平[15],在其他哺乳动物物种上未见相关报道。小鼠中的研究发现MIF基因在卵母细胞、受精卵及早期胚胎发育的各个时期均有表达,2细胞期表达水平最高,这提示MIF可能在哺乳动物胚胎早期发育中起到重要的调节作用,但需要进一步的研究来证明。MIF蛋白具有氧化还原酶的特性,可以通过调控细胞还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)水平使细胞免受氧化应激[4]。保持氧化还原内稳态对胚胎发育至关重要[16],胚胎氧化还原水平失调会引起发育阻滞、DNA损伤、基因表达改变和凋亡等[17]。因此,我们推测MIF可能通过调控GSH水平在哺乳动物胚胎早期发育中起到重要的调节作用。本实验通过实时定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)、Western-blot和显微注射的方法对MIF在牛胚胎早期发育中的表达模式和功能进行初探,为进一步阐明MIF蛋白在哺乳动物早期胚胎发育中的作用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

从西安市三桥定点屠宰场采集牛卵巢,用于收集卵母细胞。核移植供体细胞使用实验室冻存的奶牛胎儿成纤维细胞。冷冻精子购自上海光明荷斯坦牧业公司。所用的试剂除特别指明外,均购自 Sigma公司(美国)。TCM199、DMEM 和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自 ThermoFisher公司(美国);G1.5/G2.5购自Vitrolife公司(瑞典);Cell TrackerTMBlue CMF2HC Dye荧光染色剂购自Invitrogen公司(美国);蛋白酶抑制剂购自罗氏公司(瑞士);PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒购自TaKaRa公司(日本);PVDF膜购自Millipore公司(美国);Western-blot所用Whatman滤纸购自Bio-Rad公司(美国);兔源抗MIF多克隆抗体(ab7207)和兔源抗GAPDH单克隆抗体(EPR168-84)购自Abcam公司(英国);HRP标记山羊抗兔IgG二抗、蛋白质裂解液RIPA、SDS-PAGE配胶所用的30%丙烯酰胺和TEMED购自上海碧云天生物技术有限公司。细胞冻存管和细胞培养皿购自 Nunc 公司(美国)。

1.2 方法

1.2.1 卵母细胞的收集和体外成熟

将采集的牛卵巢放入15～20℃生理盐水中,6～8 h内运送回实验室,清洗3次后抽吸法采集卵母细胞。将吸取的卵泡液与采卵液以2︰1的比例混合并置入无菌的60 mm玻璃平皿中,然后放到体视显微镜下收集卵母细胞。选取卵丘细胞包裹较好且胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体放入卵母细胞成熟培养液中,在5% CO2、饱和湿度的38.5℃培养箱中进行成熟培养。成熟培养20 h后收集排出第一极体的MII期卵母细胞,准备进行后续实验。

1.2.2 体外受精(in vitro fertilization,IVF)

将荷斯坦牛细管冻精置于38℃水浴中快速解冻,解冻的精子放入平衡好的精子获能液的底部,将离心管45度倾斜,放入培养箱中培养30～45 min,完成精子上游过程。上游结束后吸取中上层3～4 mL的液体,1 000 r/min离心10 min,保留离心管底部100～200 L的液体,充分混匀。选取形态良好的MII期卵母细胞,移入平衡好的受精液微滴中,然后将处理好的精子移入此微滴中,在5% CO2、饱和湿度的38.5℃培养箱中完成受精过程。受精24 h后选出受精成功的胚胎,用透明质酸酶溶液处理去除颗粒细胞。

1.2.3 体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)

核移植供体细胞使用实验室冻存的一月龄荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞,解冻后进行细胞传代,取3～5代细胞作为核供体细胞。核移植受体细胞选取形态质量良好的MII期卵母细胞。SCNT的方法如文献[18]所述,用透明质酸酶溶液处理去除颗粒细胞,然后放入含有7.5 g/mL细胞松弛素B(cytochalasin B,CB)和10%FBS的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)中孵育15 min。准备外径为120～150 m、内径为20～30 m的核移植固定管和内径约为20 m的核移植去核管。用含7.5 g/mL CB和10%FBS的PBS在35 mm平皿内制作4个100 μL操作微滴,将处理好的卵母细胞放入其中一个微滴中。取接触抑制3 d的供体细胞,使用0.25%胰蛋白酶消化液消化后放入与卵母细胞相邻的微滴中。用固定管固定卵母细胞,用去核管扎入卵母细胞透明带下,吸取极体及极体周围部分卵母细胞胞质。去核完成后,用去核管吸取直径为15～20 m的供体细胞,将供体细胞注入去核的卵母细胞透明带下。注核时要使供体细胞尽量接触卵母细胞胞质面,不要黏附在透明带上。将完成注核的核质复合体放入融合液中平衡3～5 min,然后使用微电极法进行电融合。用融合针拨动核质复合体,将融合针放在核质接触面的垂直方向,微微压住核质复合体,操作电融合仪进行电融合。电融合参数:30 V电压,20 s脉冲时长,2次脉冲,间隔10 s。电融合后,将核质复合体放入成熟培养液,在5% CO2、饱和湿度的38.5℃培养箱中平衡2 h,然后挑选融合成功的重构胚,使用离子霉素联合6-DMAP的方法进行胚胎激活。

1.2.4 胚胎体外培养

将排出第二极体的IVF胚胎和激活后的SCNT胚胎用培养液洗涤3次,然后移入提前平衡好的G1.5培养液中,培养72 h后将胚胎移入提前平衡好的G2.5培养液中继续培养。整个培养过程都在5% CO2、饱和湿度的38.5℃培养箱中完成。分别在受精后和激活后 24 h、48 h、72 h、120 h 和168 h取IVF和SCNT胚胎的2细胞期、4细胞期、8细胞期、桑葚胚期和囊胚期胚胎。

1.2.5 牛胚胎cDNA的制备

收集所需的不同时期的胚胎,用DEPC处理的PBS(DEPC-PBS)清洗3遍。清洗后将胚胎放入含10 μL胚胎微量裂解液的无RNA酶的PCR管中,轻弹管壁,使胚胎充分裂解。向裂解液中加入2 μL提前预混好的DNA酶Ⅰ,37℃处理30 min,75℃处理5 min,以充分降解裂解液中的DNA。将制备好的RNA进行反转录,按照反转录试剂盒(PrimeScript RT Reagent Kit,TaKaRa)说明书,加入 4 μL 5× PrimeScript buffer、1 μL PrimeScript RT enzyme mix、1 μL Random 6 mers和 1 μL Oligo dT primer,并用无RNA酶超纯水补齐至20 μL。PCR反应条件:37℃15 min,85℃5 s,4℃终止反应。获得的cDNA保存于-20℃备用。

1.2.6 RT-PCR

按照RT-PCR试剂盒SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)说明书,配制 20 μL RT-PCR反应体系:10 μL 2× SYBR premix Ex Taq Ⅱ、上下游引物各 0.8 μL(20 pmol/mL)、模板 cDNA 2 μL、50× ROX reference dye 0.4 μL以及DEPC处理的超纯水6 μL。每个样品重复3次。加样完成后,采用ABI公司的StepOnePlusTMReal-Time PCR仪进行RT-PCR。RT-PCR反应条件:95°C作用30 s,随后95°C变性5 s,60°C退火并延伸30 s,该过程循环40次。在每个循环中,测量荧光,绘制熔解曲线,分析各基因的熔解曲线并用电泳鉴定PCR产物。采用2-ΔΔCt法[19]对目的基因mRNA表达水平进行相对定量分析。所用定量引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.7 Western-blot

选取50～100个卵母细胞或不同发育阶段的胚胎用于Western-blot。首先,使用台式酸溶液处理3 min左右去除胚胎的透明带,清洗3遍后放入含有蛋白酶抑制剂的蛋白质裂解液(RIPA)中充分裂解,裂解后的蛋白质样品在100℃水浴锅中变性10 min。用湿转法将蛋白质转移到PVDF膜上,转膜后将膜放入含10%脱脂奶粉的TBST液中室温封闭2 h,随后将膜转入含有目的蛋白克隆抗体(兔源抗MIF多克隆抗体和兔源抗GAPDH单克隆抗体)的封闭液中,4℃过夜孵育。一抗孵育结束后用TBST洗膜3次,每次10 min。洗涤后的膜放入含有HRP标记山羊抗兔IgG二抗的封闭液中,室温孵育2 h。孵育结束后用TBST洗膜3次,每次10 min。洗涤后的膜用化学底物发光法进行显色,然后在暗室中曝光。使用Image-Pro Plus 6.0软件(Media Cybernetics,Silver Spring,美国)对图像进行分析,以测量蛋白质条带的灰度值。将图片转换为灰度并反向颜色,修正光密度(integrated optical density,IOD)后,选择计算平均灰度所需要的条带区域,计算IOD和区域面积值,总的IOD除以总面积(sum IOD/sum area)即为图片的平均灰度。

1.2.8 显微注射

利用显微注射仪将10 pL抗MIF抗体或IgG溶液注入MII期卵母细胞胞质中。随后将卵母细胞放入5% CO2、饱和湿度的38.5℃培养箱中孵育1～2 h,使抗体与母源MIF蛋白充分结合。然后进行IVF及胚胎培养。

1.2.9 胚胎GSH水平检测

使用Cell TrackerTMBlue CMF2HC Dye(4-chloromethyl-6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin)荧光染色剂检测胚胎GSH含量。将收集的各个时期的胚胎放入含有0.2%聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)的PBS中清洗3次,然后放入含10 μmol/L Cell Tracker Blue的胚胎培养液中,38.5℃避光放置30 min。将胚胎再放入PBS-PVA中清洗3次,随后在荧光显微镜下观察并照相。激发光使用330～380 nm的紫外光,激发光打开后精确计时30 s,并使用成像系统进行拍照。

荧光信号采用配置了Nikon DS-Ril数码相机的Nikon ECLIPSE Ti-S型荧光显微镜进行检测,每组胚胎都采用相同的参数采集照片。以单个胚胎染色区域的平均荧光强度代表不同发育阶段胚胎的GSH水平。使用Image-Pro Plus 6.0计算荧光强度:将图片转换为灰度并反向颜色,修正IOD后,选择计算平均荧光强度所需要的核区域,计算IOD和区域面积值,总的IOD除以总面积即为图片的荧光强度。

1.2.10 数据分析

每组实验都至少重复3次,用SPSS 18.0(Chicago,IL)统计软件进行数据的处理和分析。采用单因素方差分析(ANOVA),不同组间选择方差齐性检验下的LSD检验进行统计学差异分析。数据均用均值±标准差(±s)表示,P<0.05被认为在统计学上具有显著性差异。

2 结果

2.1 MIF在牛IVF和SCNT胚胎早期发育过程中的表达模式

为了研究MIF在胚胎早期发育过程中的表达模式,在牛MII期卵母细胞、IVF胚胎和SCNT胚胎早期发育过程的不同阶段检测了MIF mRNA(图1)和蛋白质(图2)的表达。MIF mRNA 在 MII期卵母细胞和胚胎早期发育过程中持续表达,但都维持较低的表达量。MIF mRNA在MII期卵母细胞中表达量极低,在IVF胚胎2细胞期表达较高,随后降低,在桑椹胚期表达量最低,囊胚期再次升高。SCNT胚胎中MIF mRNA的表达模式与IVF胚胎相似,2细胞期表达较高,随后降低,桑椹胚期表达量最低,囊胚期再次升高,但其表达量在2细胞期、4细胞期、8细胞期和囊胚期显著高于IVF胚胎,在桑椹胚期差异不显著。

图1 MIF mRNA在MII期卵母细胞、IVF胚胎和SCNT胚胎中的相对表达量*P<0.05,表示同组数据差异显著。Fig.1 Relative expression levels of MIF mRNA in MII oocytes,IVF embryos and SCNT embryos*P<0.05,means significant difference,compared with its parallel group.

图2 MIF蛋白在MII期卵母细胞、IVF胚胎和SCNT胚胎中的表达分析(A)MIF蛋白在MII期卵母细胞和IVF胚胎中的Western-blot分析;(B)MIF蛋白在MII期卵母细胞和SCNT胚胎中的Westernblot分析;(C)MIF蛋白在MII期卵母细胞、IVF胚胎和SCNT胚胎中的相对表达量。*P<0.05,表示同组数据差异显著。Fig.2 Expression patterns of MIF protein in bovine MII oocytes,IVF embryos,and SCNT embryos(A)Western-blot analysis of MIF protein in MII oocytes and IVF embryos at the 2-cell,4-cell,8-cell and blastocyst stages;(B)Western-blot analysis of MIF protein in MII oocytes and SCNT embryos at the 2-cell,4-cell,8-cell and blastocyst stages;(C)Relative amount of MIF protein in MII oocytes,IVF embryos,and SCNT embryos.*P<0.05,means significant difference,compared with its parallel group.

MIF蛋白在MII期卵母细胞中高表达,并在胚胎早期发育过程中持续表达,在IVF胚胎2细胞期到8细胞期的表达逐渐降低,囊胚期表达升高。MIF蛋白在SCNT胚胎早期发育各阶段的表达模式与IVF胚胎相似,2细胞期到8细胞期的表达逐渐降低,囊胚期表达升高,但是MIF蛋白的表达量在SCNT胚胎早期发育各阶段显著低于IVF胚胎。

和IVF胚胎相比,SCNT胚胎生产过程中存在一个去核过程,该过程会去掉卵母细胞核及周围约1/4的胞质。为确定是否是去核过程影响了SCNT胚胎中MIF蛋白的表达量,我们对去核和未去核卵母细胞中MIF的表达量进行了研究,发现与未去核MII期卵母细胞相比,去核后MII期卵母细胞中MIF蛋白的表达量显著降低(图3)。

图3 MIF蛋白在未去核和去核MII期卵母细胞中的表达分析(A)MIF蛋白在未去核和去核MII期卵母细胞中的Western-blot分析;(B)MIF蛋白在未去核和去核MII期卵母细胞中的相对表达量(*P<0.05)。Fig.3 Expression patterns of MIF protein in unenucleated and enucleated bovine MII oocytes(A)Western-blot analysis of MIF protein in unenucleated and enucleated MII oocytes;(B)Relative amount of MIF protein in unenucleated and enucleated MII oocytes(*P<0.05).

2.2 干扰MIF的表达对牛胚胎早期发育率的影响

由于MIF mRNA在MII期卵母细胞和早期胚胎发育过程中表达量很低,使用microRNA干扰的方法不能有效降低MIF蛋白的表达量,因此本实验选择显微注射MIF抗体的方法来干扰MIF蛋白的表达。为了研究MIF蛋白对胚胎早期发育的影响,我们统计了MIF抗体注射组IVF胚胎、IgG注射组IVF胚胎、对照组IVF胚胎和SCNT胚胎的早期发育率(表2),发现24 h卵裂率在4组中没有显著差异,但是MIF抗体注射组的囊胚率显著低于其他3组(17.3%vs.35.3%,36.5%,33.1%,P<0.05),且MIF抗体注射组的囊胚细胞数也显著低于其他 3 组(85.6±9.3 vs.106.8±11.4,110.2±10.5,114.4±11.2,P<0.05)。此外,MIF抗体注射组中更多的胚胎发生8细胞阻滞,8细胞阻滞率显著高于其他3组(51.2%vs.32.8%,29.5%,35.6%,P<0.05)。

表2 干扰MIF对牛IVF胚胎早期发育率的影响Table 2 Effect of MIF inhibition on in vitro development of IVF bovine embryos

2.3 干扰MIF的表达对牛IVF胚胎GSH水平的影响

为了验证MIF蛋白对IVF胚胎GSH水平的影响,我们检测了MIF干扰组和对照组胚胎在2细胞期、4细胞期、8细胞期和囊胚期的GSH水平(图4)。MIF干扰组胚胎的GSH水平在2细胞期和4细胞期显著低于对照组,8细胞期和囊胚期差异不显著。

图4 干扰MIF对IVF胚胎早期发育不同时期GSH相对荧光强度的影响*P<0.05,表示同组数据差异显著。Fig.4 Effect of MIF inhibition on the relative fluorescence intensity of GSH in anti-MIF-IVF embryos and noninjected IVF embryos at the 2-,4-,8-cell and blastocyst stages*P<0.05,means significant difference,compared with its parallel group.

2.4 改变牛IVF胚胎GSH水平对胚胎早期发育的影响

GSH在细胞内是通过γ-谷氨酰循环合成的,半胱氨酸是其合成过程中一个重要的活性氨基酸前体,在培养液中添加半胱氨酸可以显著提高胚胎中的GSH水平,而在培养液中添加GSH合成酶抑制剂丁硫胺酸亚砜胺(buthionine sulfoximine,BSO),可以显著降低胚胎中的GSH水平。为了研究胚胎GSH水平对早期发育率的影响,我们在胚胎培养液中添加0.1 mg/mL半胱氨酸或5 mmol/L BSO,以上调或下调牛IVF胚胎GSH水平,染色后计算荧光强度。图5的结果显示:与IVF对照组相比,添加半胱氨酸可以显著提高牛2细胞期、4细胞期和囊胚期GSH水平,添加BSO则显著降低牛2细胞期、4细胞期、8细胞期和囊胚期GSH水平;MIF干扰组胚胎的GSH水平在2细胞期和4细胞期显著低于IVF对照组,在2细胞期、4细胞期、8细胞期和囊胚期显著低于半胱氨酸处理组,但在2细胞期和8细胞期显著高于BSO处理组;向MIF干扰组胚胎培养液中添加半胱氨酸显著提高2细胞期和4细胞期GSH水平,但其GSH水平与IVF对照组无显著差异。以上信息说明,干扰胚胎MIF的表达显著降低胚胎早期GSH水平,添加半胱氨酸可以使胚胎GSH水平恢复到正常水平。

图5 添加半胱氨酸或BSO对IVF胚胎早期发育不同时期GSH相对荧光强度的影响同一组内不同小写字母(a,b,c,d)代表差异显著(P<0.05)。Fig.5 Effect of cysteine or BSO on the relative fluorescence intensity of GSH in IVF embryos at the 2-,4-,8-cell and blastocyst stagesValues with different lowercase letters(a,b,c,d)within groups are significantly different(P<0.05).

进一步对不同GSH水平的各处理组IVF胚胎的早期发育率进行统计(表3),发现GSH水平最低的BSO处理组胚胎的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数都显著低于对照组和其他处理组,8细胞阻滞率则显著高于对照组和半胱氨酸处理组;GSH水平最高的半胱氨酸处理组胚胎的囊胚率显著高于对照组和其他处理组,卵裂率和囊胚细胞数也高于对照组,但差异不显著;向MIF干扰组胚胎培养液中添加半胱氨酸显著提高了胚胎的囊胚率和囊胚细胞数,同时显著降低了胚胎的8细胞阻滞率。上述结果说明,胚胎GSH水平和IVF胚胎早期发育率及囊胚细胞数呈正相关,与8细胞阻滞率呈负相关。

表3 改变GSH水平对牛IVF胚胎早期发育率的影响Table 3 Effect of GSH levels on in vitro development of IVF bovine embryos

3 讨论

本实验研究了MIF mRNA和蛋白质在牛IVF胚胎和SCNT胚胎早期发育过程中的表达模式,发现MIF mRNA在IVF胚胎和SCNT胚胎早期发育过程中都呈现较低水平的持续性表达(图1)。这个结果与之前在小鼠上的研究结果[15]相似,Suzuki等[15]以小鼠卵母细胞和附植前胚胎为研究对象,分析了MIF的转录表达水平,发现MIF在卵母细胞、受精卵及胚胎早期发育过程中持续表达,且在2细胞期呈现高的表达水平。但是该研究未涉及MIF mRNA在SCNT胚胎早期发育过程中的表达和MIF蛋白的表达。我们的研究发现,MIF mRNA在SCNT胚胎中的表达模式与IVF胚胎一致,都呈现持续性表达,但是MIF mRNA在SCNT胚胎2细胞、4细胞、8细胞和囊胚期的表达显著高于IVF胚胎(图1);MIF蛋白在IVF胚胎和SCNT胚胎早期发育过程中都呈现持续性表达,但SCNT胚胎的表达量显著低于IVF胚胎(图2)。为确定是否是SCNT去核过程去掉的卵母细胞核及部分胞质影响了SCNT胚胎中MIF蛋白的表达量,我们对去核和未去核卵母细胞中MIF的表达量进行了研究,发现去核后MII期卵母细胞中MIF蛋白的表达量显著低于未去核的MII期卵母细胞(图3)。MIF mRNA在胚胎早期发育中维持较低的表达量,因此,去核过程丢失的部分MIF蛋白可能是SCNT胚胎MIF蛋白表达量显著低于IVF胚胎的重要原因。

我们进一步干扰了MIF在牛IVF胚胎中的表达,以研究其在早期胚胎发育中的作用。研究结果显示,干扰MIF显著降低囊胚率和囊胚细胞总数,且更多的胚胎在8细胞期之前发生发育阻滞(表2)。囊胚细胞总数是衡量囊胚质量的重要参数。我们的结果说明,MIF在哺乳动物胚胎早期发育中发挥重要作用,干扰MIF对囊胚质量和发育能力有显著的负面影响。相关研究报道,抑制MIF在非洲爪蟾胚胎中的表达,胚胎的神经形成完全受阻,处于尾芽期的胚胎完全缺乏神经和中胚层组织,且头尾结构也严重缺陷[12];抑制MIF在斑马鱼胚胎中的表达,斑马鱼胚胎显示出畸形的眼睛、顶盖和第四脑室区域的异常肿胀,以及未发育的颌软骨和胸鳍[13]。这些结果和我们的结果都说明,MIF对胚胎发育非常重要,干扰MIF会引起胚胎发育的阻滞或异常。

GSH是机体内的一个天然的氧自由基清除剂,通过保持细胞内氧化还原状态的稳定,使细胞免受氧化应激带来的伤害。保持氧化还原内稳态对胚胎发育至关重要[16],胚胎氧化还原水平失调会引起发育阻滞、DNA损伤、基因表达改变和凋亡等。研究证明,GSH在成熟卵母细胞中呈现高的表达水平,使受精卵和早期胚胎免受氧化损伤[20]。为了研究MIF是否通过调控GSH在早期胚胎发育中发挥作用,我们检测了干扰MIF后胚胎的GSH水平,发现干扰MIF显著降低了胚胎在2细胞期和4细胞期的GSH水平,8细胞期和囊胚期的GSH水平也低于正常胚胎(图4)。这个结果与Koga等[21]的研究结果相似,在心脏中敲除MIF导致其GSH水平降低,氧化型谷胱甘肽(L-glutathione oxidized,GSSG)水平升高,氧化应激水平升高。细胞水平的研究也获得相似结果,在过氧化氢(H2O2)等过氧化物的刺激下,细胞MIF蛋白水平升高[22],引起细胞GSH浓度的显著提高[4]。

我们在胚胎培养液中添加半胱氨酸或BSO来改变胚胎GSH水平,发现胚胎GSH水平和胚胎早期发育率及囊胚细胞数呈正相关,与8细胞阻滞率呈负相关。向MIF干扰组胚胎培养液中添加半胱氨酸可以使胚胎GSH水平恢复到正常水平,且显著提高胚胎的囊胚率和囊胚细胞数,同时显著降低胚胎的8细胞阻滞率,使胚胎早期发育率恢复正常水平(图5,表3)。这个结果与De Matos等[23]的研究结果一致,在体外培养牛胚胎时加入GSH可以降低胚胎阻滞率,提高胚胎质量。

综上所述,干扰MIF的表达显著降低牛IVF胚胎的体外发育能力和囊胚质量,降低早期胚胎GSH水平;提高MIF干扰组胚胎的GSH水平可以改善胚胎早期发育率和囊胚质量。我们的结果证明,MIF蛋白在牛IVF胚胎早期发育过程中发挥重要作用,通过调控胚胎GSH水平影响胚胎早期发育能力和囊胚质量。有趣的是,SCNT胚胎在去核过程中丢失大量MIF蛋白,导致SCNT胚胎早期发育过程中MIF蛋白的表达量显著低于IVF胚胎。降低的MIF蛋白可能会引起胚胎GSH水平异常,进而引起一系列的发育异常。SCNT胚胎普遍存在的重编程异常也与胚胎异常的氧化还原水平有关。因此,去核过程中母源MIF蛋白的降低可能是SCNT胚胎重编程不完全和克隆效率低下的一个原因,但这需要进一步的研究来证明。