含镁微球-凝胶复合体对MC3T3-E1细胞黏附和增殖的影响*

王丽喆 王 英 谈 飞 李 雪 王少磊 夏晓敏 刘 杰

骨组织工程旨在为创伤、感染、肿瘤或其他原因造成的骨缺损提供安全、有效、微创的骨组织修复方案［1，2］。与传统的自体骨移植和异体骨移植相比，可注射组织材料操作简单、对宿主损伤小且费用低，具有广阔的应用前景［3，4］。近年来可注射水凝胶已广泛应用于生物医学，例如作为骨组织工程、生物传感和药物传递技术以及细胞固定的支架［5］。藻酸盐水凝胶因其具有良好的生物相容性、能够模拟天然细胞微环境、可塑性强且能够在体内安全降解，被视为理想的骨修复生物材料之一［6］。在多数研究中，钙离子常被选择为藻酸盐水凝胶的交联剂，但单纯的藻酸钙水凝胶由于其高度亲水性使得细胞黏附困难，同时缺乏诱导骨细胞增殖以及成骨分化的作用［7］。镁是人体内含量占第四的矿物元素，其一半的含量存在于骨骼中，研究表明镁离子参与成骨细胞的连接与分化，加速矿化过程以促进骨骼的发育和愈合，同时具有促进细胞黏附、增殖的作用［8-11］。

生物可吸收高分子微球逐渐被用作治疗组织缺陷的生物材料，得益于它们填充不规则形状缺陷的能力和微创操作的优势。乳酸-羟基乙酸共聚物（poly(lactic-co-glycolic acid，PLGA）由于优异的降解性、生物相容性、低免疫原性和低毒性而广泛应用于骨组织工程，已经被美国食品与药品管理局批准可用于药物控释的载体［12］。本实验即采用乳化法制备载有镁的PLGA（PMg）微球，旨在将微球添加到藻酸盐水凝胶中形成微球凝胶复合体，使镁离子能够均匀、稳定地释放，并发挥其增强细胞黏附、增殖的作用，同时改善凝胶的理化性能。

1.材料与方法

1.1 主要材料和试剂 海藻酸钠粉末（Sigma，美 国）；PLGA（Aladdin， 中 国）；氧 化 镁 粉 末（Aladdin， 中国）；碳酸镁粉末（Aladdin， 中国）；二氯甲烷（Aladdin， 中国）；吐温-60（国药，中国）；司班-80（Aladdin， 中国）；聚乙烯醇1788（Aladdin， 中国）；分析纯CaCl2（上海源叶生物科技有限公司）；活死细胞染色检测试剂盒（大连美仑生物技术有限公司）；溶菌酶（索莱宝，中国）；磷酸盐缓冲液（大连美仑生物技术有限公司）；CCK-8试剂盒（ 大连美仑生物技术有限公司）；MC3T3-E1 subclone14 小鼠前成骨细胞（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）。

1.2 实验主要设备 扫描电镜（Nova 公司，德国）；荧光显微镜（Olympus 公司，日本）；ICP-OES optima8000（PerkinElmer 公 司，美 国）；0.001 g精度电子天平（setra，美国）；磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司，中国）；多功能酶标仪（Tecan Safire2，瑞士）。

1.3 负载MgO和MgCO3的PLGA（PMg）微球制备 将0.5 g PLGA溶于10 mL二氯甲烷中，涡旋振荡以保证完全溶解，向其中加入1 mL 1%的司班-80、0.125 g MgO 和0.125 g MgCO3，均质（18000 rpm）后得到悬浮液。向100 mL 1%的聚乙烯醇（PVA）溶液中加入1 mL 10%的吐温-60溶液，用磁力搅拌器将二者混匀。将获得的MgO和MgCO3悬浮液缓慢滴入到配置好的PVA溶液中，使用机械搅拌并置于通风橱内挥发固化成球。使用去离子水将微球洗涤三遍，冻干后收集备用。

1.4 PMg-藻酸盐凝胶复合体的制备 以磷酸盐缓冲液（PBS）作为溶剂，配置最终浓度为3% wt的海藻酸钠溶液；以双蒸水为溶剂，配置最终浓度为5 g/L的氯化钙溶液，将其与配置好的等量海藻酸钠溶液混合，使用特定模具制成直径为1 cm 的凝胶圆盘，命名为A 组（对照组）；分别称取PMg 微球 3 mg、9 mg、15 mg 和21 mg，均 匀 分 散 于3mL 配置好的氯化钙溶液中，形成平均密度ρ 为1×10-3kg/m3、3×10-3kg/m3、5×10-3kg/m3、7×10-3kg/m3的悬浊液，同样与等量的海藻酸钠溶液混合，使用特定模具制成直径为1 cm 的凝胶圆盘，命名为B、C、D、E组（实验组）。

1.5 表面形貌观察及元素分析 将PMg 微球、凝胶样本均匀粘在导电胶上，使用喷金仪均匀喷涂一层铂金，用SEM 观察微球的表面形貌。任意选取视野中微球表面3个点，用X 射线光电子能谱分析仪（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）进行电子能谱分析，确定其表面化学组成。

1.6 凝胶样本中Mg2+析出浓度检测 称量3 mg PMg微球分散于9 mL 37℃的α-MEM培养基中；另将各组凝胶样本（n=5）完全浸入1 mL 37℃培养基中，在浸泡后第1、3、5、7、14、21天的同一时间分别收集微球及各组凝胶的浸泡液，利用电感耦合等离子体光谱仪（ICP-OES optima8000）测定浸泡液中Mg2+浓度，记录数据。

1.7 凝胶样本溶胀率检测 将制备好的各组凝胶样本（n=4）分别于PBS和双蒸水中充分溶胀24 h后，测量湿重W1及干重W2，按照以下公式计算溶胀率：（W1—W2）/W2，每组计算后取均值。

1.8 凝胶样本降解率检测 制备凝胶样本（n=4），称量其初始重量记为W0并将其置于24孔板内；向每孔加入1 mL 0.5 mg/L的溶菌酶溶液， 每24 h更换一次溶菌酶溶液，在浸泡的第1、3、5、7、14、21天分别取出样本称重，记为W1。支架剩余质量分数（w）计算公式：w(%)=W1/W0×100%。

1.9 细胞培养及接种 以MC3T3-E1 细胞株作为本实验的种子细胞，当生长密度超过80%时，用胰蛋白酶消化，离心，弃上清液，加入含有10%胎牛血清、5%青霉素链霉素的完全培养基4 mL，分至两个培养瓶中，补培养基至4 mL，常规置37℃，5%CO2和饱和湿度的条件下培养。培养两代后收集细胞，经胰蛋白酶消化后吹打均匀，调整细胞悬液密度至5×106个/L，在24孔板内每孔加入60 uL，后添加培养基至1 mL。

1.10 细胞黏附形态的扫描电镜观察MC3T3-E1细胞于凝胶样本表面接种18 h后，将样品置于戊二醛固定液中固定，脱水干燥，用扫描电镜观察。

1.11 细胞黏附率的检测 将调整后的细胞密度为5×106个/L的细胞悬液分别接种于3个批次的24孔板中，分别标记2 h、6 h和18 h，均放置于37℃、5%CO2培养箱内，分别于培养后2 h、6 h、18 h时取出，消化离心后吹打制成细胞悬液。使用细胞计数板分别对三个批次的每组细胞进行计数，计算黏附率。细胞黏附率（%）=已贴壁细胞数/接种细胞总数×100%。

1.12 活/死细胞染色观察 将接种后的MC3T3-E1细胞分别于第1、3、5天采用AM/PI染色，观察细胞在凝胶表面的增殖活性。在倒置荧光显微镜下使用490±10 nm激发波长时观察活细胞（黄绿色荧光）和死细胞（红色荧光）。

1.13 CCK-8 法检测细胞毒性及增殖活性 在MC3T3-E1 细胞接种后的第1、3、5 天，以10∶1 的比例将CCK-8试剂滴加到接种种子细胞的凝胶复合体的培养基中，将孔板置于37℃、5%CO2培养箱内避光孵育2 h后取出，吸取100μL孔板中的培养基与CCK-8 混合液至96 孔板，450 nm 波长下测吸光度值OD450。细胞毒性实验仅计算第1 天的细胞相对存活率，细胞相对存活率＝［(实验孔OD值-空白孔OD 值)/(对照孔OD 值-空白孔OD值)］×100%。

2.结果

2.1 表面形貌观察及元素分析 使用SEM在2000倍下观察微球形貌，可见微球表面呈多孔状，孔隙大小不均，微球直径大小在20-60μm之间。对PMg微球表面进行EDS元素分析，如图1所示，镁元素被成功添加到微球中，其原子数百分含量为9.76%，质量百分比为16.35%。

图1 PMg微球微观形貌及其表面元素分析结果

在100 倍镜下观察各组水凝胶样本，如图2 所示，均呈现多孔隙的三维海绵状结构。其中C、D、E组PMg-藻酸盐凝胶复合体可见明显的、数量较多的PMg 微球粘连在水凝胶的内部结构中。在各组样本中，A 组水凝胶孔隙直径较大，整体结构较为疏松，孔径约为500μm；而随着微球数量的增加，PMg-藻酸盐凝胶复合体逐渐呈现出更加密集的结构。

图2 各组凝胶样本微观形貌A：单纯Ca2+藻酸盐凝胶；B：平均密度为1×10-3 kg/m3的PMg-藻酸盐凝胶复合体；C：平均密度为3×10-3 kg/m3的PMg-藻酸盐凝胶复合体；D：平均密度为5×10-3 kg/m3的PMg-藻酸盐凝胶复合体；E：平均密度为7×10-3 kg/m3的PMg-藻酸盐凝胶复合体

2.2 ICP-EOS 检测凝胶及PMg 微Mg2+析出浓度 单纯的PMg 微球在溶液中的Mg2+存在突释现象，在浸泡的第1天时释放量最多，第3天释放量明显下降，7 天后释放趋势明显缓和（图3A）。而PMg-藻酸盐凝胶复合体中Mg2+的释放量在7 天之内较为平均，随着时间的推移，各组PMg-藻酸盐凝胶复合体释放到溶液中的Mg2+的浓度无明显上升或下降，其释放趋势较为稳定；7 天后至第21天，其释放浓度开始降低。4 组实验组中的Mg2+析出浓度均随着微球量的增加而增大（P＜0.05）（图3B）。

图3 A：不同时间点PMg微球浸泡液中Mg2+的析出浓度；B：不同时间点PMg-藻酸盐凝胶复合体浸泡液中Mg2+的析出浓度

2.3 凝胶溶胀率检测 表1展示出各组凝胶分别在ddH2O和PBS中溶胀率的变化。结果表明，在藻酸钙水凝胶中加入PMg微球，能够使凝胶的溶胀率增大，且与对照组相比，均有统计学意义（P＜0.05)；但各个实验组之间的溶胀率数值没有统计学差异。

表1 各组凝胶样本的溶胀率检测（±s）

表1 各组凝胶样本的溶胀率检测（±s）

*表示与A组相比有统计学差异（P＜0.05）

PBS 36.60±1.84 42.48±1.41*43.59±4.53*44.76±4.53*44.27±2.47*组别ABCDE ddH2O 54.75±2.19 63.20±1.64*64.52±3.43*64.71±5.81*66.76±4.37*

2.4 凝胶降解率检测 如图4 所示，随着时间的推移，各组水凝胶的质量均下降，21 天时E 组剩余质量最多，为初始质量的45.46%；而A 组剩余质量最少，仅为初始质量的15.78%。随着微球含量的增加，PMg-藻酸盐凝胶复合体的降解率逐渐减缓，其中第1 天B、C、D、E 组与对照组之间均有统计学差异（P＜0.05），第3 天C、D、E 组与对照组之间有统计学差异；第7 天以后至第21 天，仅D、E 组与对照组之间有统计学差异（P＜0.05）。

图4 各组凝胶在不同时间点的降解率

2.5 凝胶表面细胞的毒性检测 细胞毒性实验显示，细胞接种1 天后，对照组的细胞相对存活率归一化处理为100%，各实验组的细胞相对存活率与对照组相比无差异（图5），说明本实验所使用的PMg-藻酸盐凝胶复合体生物相容性良好，可用作后续的实验研究。

图5 细胞接种1d后，各组的细胞相对存活率

2.6 凝胶表面的细胞黏附形态观察 在500 倍镜下观察凝胶表面的细胞发现，C、D 组伸展数量较多，其中C 组黏附情况较好，数量最多；A、E 组细胞黏附数量较少。在2000 倍镜下观察，B、C、D 组细胞个体伸展形态良好，有较多突出的纺锤状伪足，且黏附面积更大；A组细胞尚可见伸展的伪足，而E组细胞大多呈球形，未观察到较多伸展及有伪足的细胞（图6）。

图6 细胞接种18 h后，扫描电镜观察细胞黏附形态。a.A组，×500；b.A 组，×2000；c.B组，×500；d.B组，×2000；e.C 组，×500；f.C 组，×2000；g.D 组，×500；h.D 组，×2000；i.E 组，×500；j.E 组，×2000

2.7 凝胶表面细胞黏附率 如图7所示，各组细胞黏附率呈时间依赖性增加；其中在18 h时C组细胞的黏附率显示出最高，与A、B、E组相比有统计学意义（P＜0.05）。在2 h、6 h时B、C、D、E组随着Mg2+浓度的增加，其黏附率相应升高（P＜0.05）。

图7 细胞培养2 h、6 h、18 h时各组凝胶表面的黏附率。*表示与A组相比有统计学差异（P＜0.05）

2.8 凝胶表面细胞的活/死荧光染色观察A、B、C、D 4 组活细胞数量随着时间的延长而增多，且黏附形态呈长梭形或多角形。细胞培养的第3天和第5 天，随着Mg2+浓度的增加，B、C、D、E 组死细胞数量均不同程度上升，其中E 组死细胞数量占比最大，且细胞形态多呈球形，有伪足伸展的细胞数量较少（图8）。

图8 AM/PI活、死细胞染色图，其中绿色为活细胞，红色为死细胞。a、b、c分别为A 组接种MC3T3-E1细胞后第1、3、5天；d、e、f分别为B组接种MC3T3-E1细胞后第1、3、5天；g、h、i分别为C 组接种MC3T3-E1细胞第1、3、5天；j、k、l分别为D 组接种MC3T3-E1细胞第1、3、5天；m、n、o分别为E 组接种MC3T3-E1细胞第1、3、5天

2.9 凝胶表面细胞的增殖活性检测 细胞增殖实验显示，随着时间的延长，各组凝胶表面的细胞增殖活性逐渐上升（P＜0.05）。第1 天时各组之间的细胞增殖活性没有明显的差异；在第3 天和第5天时，随着Mg2+浓度的升高，A、B、C、D 组细胞增殖行为明显被促进，其中D 组表现出最高的增殖活性；而E组与D组相比，在第5天时其增殖活性明显下降（P＜0.05）。

3.讨论

藻酸盐是一种来源于褐藻的线性、非支链共聚物，它可与Ca2+、Sr2+、Zn2+等二价阳离子交联形成水凝胶［13］。藻酸盐水凝胶通常使用Ca2+作为交联剂，但藻酸钙水凝胶极易与钠离子发生置换而导致结构坍塌［14］。除此之外，藻酸钙水凝胶具有高度的亲水性，细胞难以黏附于其表面，而单纯的Ca2+诱导骨细胞增殖及成骨分化的作用较弱，这些缺点限制了藻酸盐水凝胶在骨组织工程中的应用与发展［15，16］。近年来不少研究报道证明，镁能够加速骨折愈合，促进骨组织的重建和再生［8，17］。Okawachi等人发现用氯化镁对钛表面进行水热处理能够增强Sa3上皮细胞和NIH3T3成纤维细胞的早期黏附［10］。本实验前期预实验对MgCO3和MgO 进行了不同浓度比例的筛检，结果发现MgO 的比例越大，Mg2+的释放速率就越快，被微球包埋的镁元素会在很短的时间被释放出来，而加入MgCO3后，突释行为得到了有效的缓解。另外，Yuan 等人通过将不同比列的MgCO3和MgO 包埋入PLGA 微球，发现当MgCO3：MgO=1∶1时，PMg 微球的初期爆发释放行为相对缓和［18］。因此本实验将MgCO3和MgO 按1∶1包裹在PLGA 微球中，再将微球掺入凝胶，利用微球的缓释功能使镁能够长效、稳定地发挥其生物作用，促进MC3T3-E1 细胞的黏附、增殖，同时改善凝胶的理化性能，延缓其降解速率。

实验结果表明，在藻酸盐凝胶中添加PMg微球，使凝胶的内部结构更加致密，增加了凝胶溶胀率的同时减缓了降解速率，并且微球添加量越多，Mg2+的释放量随之增加，凝胶的剩余质量越多，其降解率呈现Mg2+剂量依赖性减缓，这可能是由于Mg2+从微球中释放出来后与藻酸盐结合成胶，弥补了凝胶中流失的一部分Ca2+从而延缓了凝胶的降解，这也解释了为什么在凝胶中加入微球之后，Mg2+在单纯微球浸泡液中的突释现象得到了明显改善。包裹了PMg微球的水凝胶由于其能够与从微球中释放出的Mg2+产生物理交联，因此可充分减缓微环境中Mg2+浓度的上升速率，尤其在1、3、5、7天时，Mg2+的释放尤为均匀、稳定。实际上，在以往研究中也有类似的结果，例如Yuan等人发现PMg微球在浸泡7天时其镁离子释放百分比接近50%，7天后的释放速率明显减缓，这与我们的实验结果一致［18］。因此我们可以推测第14、21天微球-凝胶复合体的释放浓度减低是由于微球中的Mg2+大部分已经释放，且在其初期爆发释放时其浓度被凝胶有效地缓冲。在Yuan等人的实验结果中我们还可以得知，PMg微球在28天时依旧稳定释放，并未出现终末爆发释放的现象。同样的，Lin等人、Brown等人也做了有关PLGA微球包裹Mg2+的实验，结果均未发现在材料降解的终末时间出现爆发释放，这也充分证明了PLGA微球作为药物载体具有降解稳定性［19，20］。

由于镁离子是扩散结合而不是强位点结合，因此与藻酸盐之间并不会迅速成胶［21］。一般来说，镁-藻酸盐溶液的物理化学特性强烈地依赖于藻酸盐的组成，特别是藻酸盐主干中G嵌段与M 嵌段的比率［16］。Topuz 等人的研究证实了在镁与藻酸盐的反应过程中，藻酸盐G 嵌段的含量越高，凝胶越易形成［21］。此外，许多研究表明，相对稳定的凝胶溶胀可能为细胞黏附、扩散甚至成骨提供更加舒适的环境［22，23］。而在本研究中各实验组之间的溶胀率无明显差异，这可能与实验组组间Mg2+浓度差值过小有关。在Yin 等人的研究中，Mg2+浓度差值在10倍时，凝胶溶胀率有明显的差异［16］。

细胞实验结果表明，各组凝胶释放出的Mg2+浓度均在安全范围之内，各实验组的黏附行为和增殖活性均高于对照组，说明所制备的PMg-藻酸盐凝胶复合体具备良好的生物相容性，并且有效地促进了细胞在其表面的黏附和增殖。结合离子析出和细胞黏附实验结果，A、B、C 组随着Mg2+析出浓度的增加，细胞黏附率上升，而D、E 组Mg2+析出浓度继续增大，在18 h 时所累积的浓度已经不利于细胞的黏附。可见，Mg2+浓度对细胞的黏附行为有着重要的影响。此外，细胞与材料之间的黏附是一个复杂的过程，受到与材料相关的多重因素的影响，例如表面结构、润湿性、电荷等［24，25］。有文献报道，整合素能够与配体结合随后作用于某些细胞内信号通路继而影响细胞的黏附行为，因此作者推测，将载有镁的微球添加到藻酸盐凝胶中促进了细胞的粘附行为可能与Mg2+增强了整合素的表达有关［26，27］。另外，掺入的Mg2+可能增强了凝胶表面的硬度，研究表明，细胞更倾向在表面硬度较强的基质上黏附并呈现出伸展的形态［23］。在细胞增殖实验中，D 组表现出最佳的增殖活性，E 组在第5 天时与D 组相比其增殖活性明显下降，说明在D 组浓度对细胞增殖效果最佳。

众所周知，Mg2+在溶液中产生碱性环境，而PLGA 的降解产物是乳酸和羟基乙酸，二者在生理温度下产生微量的乳酸钙和乳酸镁，它们的生成一方面在一定程度上缓冲了微环境中的PH 值，同时实际上体液循环也能够大大减缓局部离子释放造成的潜在电解质及酸碱性等微环境的改变；另一方面在后期的细胞成骨分化及钙盐沉积的过程中起到了一定的促进作用，为PMg-藻酸盐凝胶复合体在成骨方面的应用奠定了基础［19，28］。

综上，本实验所制备的PMg-藻酸盐凝胶复合体能有效地促进MC3T3-E1 细胞在其表面的黏附、增殖，其中平均密度为3×10-3kg/m3的C 组细胞黏附效果最佳，而平均密度5×10-3kg/m3的D组细胞增殖效果最佳；与此同时也改善了凝胶的降解速率，使Mg2+更加均匀、稳定地释放。另外，基于Mg2+在诱导成骨中的重要作用，这种新型PMg-藻酸盐凝胶复合体可能对前成骨细胞后期的成骨与分化有着潜在影响，这些特征使得其成为骨组织工程中很有前景的支架材料。