生理盐水稀释液对高浓度精液标本计算机辅助精子分析结果的影响

孟庆昊,杨斯桀,高选

(1.山东大学生殖医学研究中心(山东大学附属生殖医院)，济南250002；2.国家辅助生殖与优生工程技术研究中心，济南250002)

精液常规分析是了解男性生育力最基本的重要检测技术，是男科实验室和辅助生殖实验室最常规的检测项目，而精子浓度和前向运动精子百分率是其中的重要指标。人工分析由于效率低、受技术员主观判断的影响大，现已逐渐被计算机辅助精子分析(computer-aided sperm analysis，CASA)取代。CASA系统通过摄像机与显微镜连接，跟踪和确定单个精子的活动，根据设定精子运动的位移、精子大小和灰度及精子运动的有关参数，对采集到的图像进行动态处理分析[1]。对于精子浓度高的标本，精子间重叠严重，会导致拍摄的精子浓度低于实际浓度。同时，精子之间距离过近，发生碰撞的概率增大，导致前向运动精子百分率假性增高。此外，精子浓度过高或者速率过大也会导致轨迹跟踪出错，错配概率增大，导致运动精子百分率升高[2]。生理盐水易于获得、可以维持精子内外渗透压和电解质平衡，因此实验室实际操作中通常对高浓度精液标本采用生理盐水稀释，但其对CASA的检测结果影响报道较少。本研究探讨以生理盐水稀释高浓度精液标本，采用CASA方法检测对精子浓度、前向运动精子百分率的影响。

1 材料与方法

1.1标本来源 选取2020年9月至2020年12月于山东大学附属生殖医院进行精液常规检查的精子浓度>100×106/mL的门诊患者精液标本118例，排除以下情况标本：①黏稠精液；②白细胞精液症；③镜下可见红细胞；④禁欲时间<2 d或>7 d。

1.2标本采集及精液分析 嘱患者禁欲2～7 d，手淫法取精，将全部精液收集于清洁、干燥的精液采集器(深圳博锐德公司)内，于30 min内37 ℃保存送至实验室，将精液置于37 ℃恒温水浴箱内液化。采用乳胶质控珠进行精子浓度的室内质控，实验期间每日室内质控均在控，2个浓度水平的变异系数分别为4.01%、3.76%。参加广东省精子库2020年度室间质评，精子浓度与活动力的室间质评成绩均为100%。待精液液化后用一次性吸管将精液充分混匀，用移液器取7 μL充池(一次性精液分析玻片，20 μm，广东友宁公司)。该批次的一次性精液分析玻片进行了质量验证，满足质量要求。采用SCA-H-01精子分析仪(西班牙Microptic公司)对精液进行计算机辅助常规分析，检测精子浓度、前向运动精子百分率等精液常规参数。

标本液化后30 min内用生理盐水进行1∶1、1∶3、1∶7稀释并分析；8 000×g、5 min进行离心后，精浆中精子数为0～1个/HP，可以避免残留精子对稀释结果的影响；从118例标本中选取标本量充足的100例标本，取1 mL标本离心(8 000×g，5 min)取精浆，加做自身精浆1∶3稀释对照。标本稀释后10 min内完成精子浓度及前向运动精子百分率分析，每份标本至少拍摄200个精子，记录精子浓度及前向运动精子百分率。

2 结果

2.1不同比例生理盐水稀释后的CASA检测结果 通过CASA，以生理盐水1∶1、1∶3、1∶7稀释后的精子浓度值随稀释比例的增高逐渐增高，均高于以精液原液直接检测的浓度值，1∶1与原液、1∶3与1∶1比较，差异均有统计学意义(P均<0.05)；1∶7与1∶3比较，差异无统计学意义(P>0.05)；以生理盐水1∶1、1∶3、1∶7稀释后的前向运动精子百分率随稀释比例的增高逐渐降低，均低于精液原液直接检测的前向运动精子百分率，1∶1与原液、1∶3与1∶1比较，差异均有统计学意义(P均<0.05)；1∶7与1∶3比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 精液原液与生理盐水1∶1、1∶3、1∶7稀释后精子浓度、前向运动精子百分率的比较(n=118)

2.2生理盐水与自身精浆在1∶3稀释比例下的CASA检测结果 通过CASA，生理盐水1∶3稀释的精子浓度高于自身精浆1∶3稀释的精子浓度(P<0.05)，差异有统计学意义；生理盐水1∶3稀释的前向运动精子百分率低于自身精浆1∶3稀释的前向运动精子百分率(P<0.05)，差异有统计学意义。见表2。

表2 生理盐水与自身精浆稀释后精子浓度与前向运动精子百分率的比较

3 讨论

虽然精液常规分析在检验医学中的开展时间很长，但目前仍无标准化的质量控制体系及行业标准，而精子浓度和前向运动精子百分率作为精液分析中最主要的指标，检测结果对于男科医生诊断不育症至关重要。由于精子浓度的生物变异很大，故对于不同浓度水平标本应采取不同处理方式，WHO明确要求对于高浓度精液标本要进行稀释检测[3]。

胡凯等[4]认为高浓度精液标本以生理盐水、精浆作为稀释液时，在一定稀释浓度下，不会对精子浓度、前向运动精子百分率造成影响。本研究采用生理盐水稀释，发现稀释检测的精子原液浓度随稀释倍数的增加而增加，该结论与叶明桃等[5]研究不一致。分析当精子浓度高时，精子间存在相互重叠，部分被重叠的精子CASA软件无法识别，导致检测的精子浓度低于实际的精子浓度。随着稀释倍数增加，每个视野中的精子数减少，精子间重叠现象减少，所计算出的精子浓度更接近真实浓度。本研究发现对于浓度大于100×106/mL的精液标本，生理盐水1∶3稀释和1∶7稀释后精子浓度间的差异无统计学意义。研究表明精子浓度在(20～50)×106/mL时人工常规精液分析(SRA)和CASA法测定结果无差异[1，6-10]，因此建议对于浓度>100×106/mL的高浓度精液标本选择1∶3的稀释比例，旨在控制稀释的精子浓度在(20～50)×106/mL的范围内，使结果更接近真值。

本研究还发现用生理盐水稀释高浓度精液标本，随稀释倍数的增加所检测出的前向运动精子百分率会降低，与叶明桃、谢杏仪等[5，11]同样使用生理盐水稀释高浓度精液的研究结论不一致。当精子浓度偏高时，精子之间距离过近，发生碰撞的概率增大，部分没有活动能力的精子也被撞动，从而导致检测结果偏高[2]。随着稀释倍数的增加，精子发生碰撞的概率不断减小，稀释后前向运动精子百分率的检测数据便会降低。因此，本实验显示高浓度精液在不稀释的情况下检测的前向运动精子百分率结果偏高，同时也发现，生理盐水1∶3稀释和1∶7稀释后精子前向运动精子百分率间的差异无统计学意义，因此，作为辅助生殖技术方式选择的辅助指标，建议1∶3比例稀释后检测前向运动精子百分率。

在1∶3稀释比例下以自身精浆稀释的对照实验结果发现，生理盐水与自身精浆稀释的高浓度精液标本的CASA结果也有统计学差异，采用生理盐水稀释的精子浓度值明显高于自身精浆稀释，而生理盐水稀释的运动精子百分率明显低于自身精浆稀释，与叶明桃、Parker等[5，12]研究的结论不一致；推测因为精浆中存在果糖等物质可维持精子的运动，正常精液分离出的精浆可刺激弱精子症患者的精子，使活动力低下精子提高活力，未脱离精浆的精子可从精浆中获得营养物质以支持能量代谢及运动[13]，而生理盐水只含有维持渗透压和电解质平衡的盐离子，其特性会使非黏稠的高浓度精液的CASA结果有偏差，因此，若精液量充足，用精浆稀释精液后进行CASA 测定可减少误差,使结果更准确,更能反映就诊患者的真实情况[6]。

本研究还存在一定局限性，对于弱精子症的患者，稀释后对结果的影响还需要进一步探索。另外，可以进一步分析不同深度的计数池和不同厂家的计数池是否也得出类似的结论。

综上所述，对于已液化的高浓度精液标本，精浆仍是最优的稀释液。对于高浓度、精液量不足的精液标本，可用生理盐水替代精浆进行稀释，但应注明以便临床医生更好地判断实际情况。