3-3’二吲哚甲烷对放射性肺损伤的防护作用及其机制研究*

杨百霞，谢国栋，倪 峰，崔晓佳，葛 琴

（南通大学附属肿瘤医院/南通市肿瘤医院放疗科，江苏 226361）

放射性肺损伤（radiation-induced lung injury，RILI）是胸部肿瘤放疗最常见的并发症之一，病变周围的肺组织因接受超过阈值的放射剂量，产生不可逆性损伤[1]。目前精确放疗技术不断改进，大大降低了辐射剂量和体积，但仍有30%以上患者发生RILI。RILI在肺癌放疗中的发病率最高（5%～25%），其次是纵隔淋巴瘤（5%～10%）和乳腺癌（1%～5%）[2]。RILI病理变化包括放射性肺炎和放射性肺纤维化两个阶段，是动态的连续过程[3-4]。目前RILI发生机制尚不明确，是由多种细胞因子参与，涉及细胞损伤、氧化应激、基因改变等复杂过程。寻找放射性肺损伤的防护药物是临床上亟待解决的问题。

3-3’二吲哚甲烷（diindolylmethane，DIM）是吲哚-3-甲醇（indole-3-carbinol，I3C）衍生物，为小分子化合物，人体口服吸收顺利，耐受性良好，无明显毒副作用[5]。I3C及DIM可以正向调节电离辐射导致的DNA损伤、修复密切相关蛋白ATM及BRCA1表达及其磷酸化[6]。DIM通过ATM/BRCA1磷酸化激活，选择性增加正常组织耐辐射能力，延长受照动物的存活时间，而不影响肿瘤组织的放射治疗敏感性[7]。本研究通过建立放射性肺损伤小鼠模型[8-11]，探讨DIM对放射性肺损伤的防护作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 120只清洁级雌性C57BL/6小鼠，体重20±2 g（无锡江南实验动物中心），自由进食进水，常温下适应性喂养3 d后用于实验。DIM（纯度＞99%，江苏普乐司生物科技有限公司），EDTA抗原修复液、抗转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）一抗（1∶100，英国Abcam公司），BSA（Sigma），二抗:HRP标记山羊抗兔（1∶200，KPL公司），抗血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）一抗（1∶100，Santa Cruz公司）；二抗:HRP标记的山羊抗兔鼠（即用型，丹麦DAKO公司）。Synergy直线加速器（瑞典ELEK-TA公司），正置光学显微镜（E100）、成像系统（DS-U3）（日本尼康公司），凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型构建:将120只C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、单纯照射组、单纯DIM组、照射+DIM组、照射+泼尼松组，每组24只。10%水合氯醛麻醉小鼠后，单纯照射组、照射+DIM组、照射+泼尼松组小鼠采用加速器6MV-X射线单次全胸照射，剂量16 Gy。照射+DIM组于照射前30 min灌胃DIM 75 mg/kg[12]，照射+泼尼松组于照射前30 min灌胃泼尼松5 mg/kg；单纯DIM组仅灌胃DIM 75 mg/kg，空白对照组给予同等容量生理盐水灌胃。小鼠经单次16 Gy X射线全胸照射后无死亡。照射后于24 h、1周、2周、4周颈椎脱臼法处死小鼠，每次每组处死6只小鼠。将肺组织以10%甲醛液固定，常规取材、石蜡包埋、切片，HE染色，于显微镜下进行观察。与空白对照组小鼠比较，主要表现为肺泡壁充血，有炎细胞浸润，与文献报道基本一致，表明模型建立成功。

1.2.2 肺组织病理学评分:根据肺组织病变（肺泡壁充血、出血、炎细胞浸润及肺气肿）程度评分:基本正常为0分，轻微或极少量计0.5分，轻度或少量计1分，中度或较多计2分，重度或多量计3分，极重度或大量计4分。根据病变区域占整个制片区域的比例评分，基本正常计0分，局部病变（＜12%）计0.5分，小范围病变（12%～25%）计1分，中等范围病变（25%～50%）计2分，大范围病变（50%～75%）计3分，广泛病变（＞75%）计4分。累加所有分数，取平均分，分值越高提示损伤程度越严重。

1.2.3 Western blot检测蛋白表达:取照射后2周的小鼠肺组织，剪碎，RIPA裂解液提取蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量。用10%SDS-PAGE分离蛋白，转移蛋白至PVDF膜。5%BSA室温封闭2 h，加入一抗，4℃封闭过夜。次日洗去一抗（TGF-β1，1∶1 000；VEGF，1∶1 200），加入二抗室温封闭1 h，将膜洗净，滴加化学发光液，凝胶成像系统获取蛋白条带图片，Image J软件对条带灰度值定量分析。

1.3 统计学处理 应用SPSS 19.0统计软件进行数据处理分析。计量资料以表示，组间差异性比较采用One-Way ANOVA检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠放射性肺损伤病变程度比较 照射后各时间点各组病变程度比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），单纯照射组病变最明显，其次是照射+泼尼松组，照射+DIM组病变程度最轻，照射后2周放射性肺损伤反应最明显。见表1、见图1。

图1 各组小鼠放射性肺损伤肺组织切片观察（照射后2w）

表1 各组小鼠放射性肺损伤评分比较 分

2.2 各组肺组织TGF-β1、VEGF蛋白表达水平比较 单纯照射组小鼠肺组织TGF-β1、VEGF蛋白表达水平高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；照射+DIM组小鼠TGF-β1、VEGF蛋白表达水平低于单纯照射组，差异有统计学意义（P＜0.05）；见图2、图3。照射+泼尼松组小鼠TGF-β1、VEGF蛋白表达水平低于单纯照射组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 各组肺组织TGF-β1、VEGF蛋白表达水平

图3 各组肺组织TGF-β1、VEGF蛋白条带灰度值统计

3 讨 论

放射治疗是治疗胸部恶性肿瘤的重要手段之一，但RILI的发生限制了放疗剂量和靶区体积[13-14]。有研究显示，重度RILI病死率高达50%[15]，胸部放疗患者有2.3%死于RILI[16]。RILI患者早期无明显临床表现，通常在晚期严重肺纤维化时才被诊断。目前临床上对RILI的治疗主要是缓解症状[17-18]，因此预防性治疗尤为关键。

RILI的发生发展涉及多种复杂因素，目前普遍认为放射线导致Ⅱ型肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤，产生多细胞因子级联反应，引起细胞因子瀑布效应，激发炎症反应，不断刺激引起肺组织纤维化[19-20]。肺组织受到辐射时引起氧化应激反应，产生大量活性氧类物质（reactive oxygen species，ROS），ROS诱导血管内皮细胞凋亡，进一步加重肺组织损伤[21-22]。而受损细胞释放细胞因子和趋化因子，促使炎性细胞迁移到受损部位，释放TGF-β1、TGF-α、IL-6等细胞因子。TGF-β1在细胞凋亡过程中发挥举足轻重的作用[23]，Ⅱ型肺泡上皮细胞通过释放TGF-β1导致肺纤维化的发生[24-25]，而TGF-β1诱导血管内皮生长因子（VEGF）的表达，进而加速肺纤维化进程[26-27]。有研究证实，DIM可通过多种机制发挥抗肿瘤作用，如调控PI3K/Akt通路增加肿瘤细胞凋亡，通过降低HIF-1抑制血管生成[28-29]。

本研究放射性肺损伤小鼠模型实验结果显示，照射前DIM干预能显著减轻小鼠肺组织损伤，显著减少放疗诱导的小鼠肺组织TGF-β1和VEGF表达，提示DIM具有辐射防护作用，可能与抑制TGF-β1/VEGF信号通路有关。DIM有望成为防护放射性肺损伤的潜在药物，但是其毒副作用、用药剂量及作用机制还需进一步研究。