快速现场评估技术在诊断性介入呼吸病学中的应用研究进展▲

谭小玉 黎雨 李文涛 陈俊健 方妮

广西医科大学第二附属医院，南宁市 530007

【提要】 快速现场评估(ROSE)技术是一项主要以细胞学、病理学和微生物学为基础，在操作现场迅速对标本开展制片和染色，以及评价和判断的诊断技术。在呼吸介入诊疗和呼吸疾病诊断中，免疫荧光标记染色ROSE技术的灵敏度和特异度较传统ROSE技术高，本文就介入呼吸病学ROSE技术的研究进展进行综述。

快速现场评估(rapid on-site examination, ROSE)是用穿刺、活检、刷片等办法收集标本，并对标本进行快速制片和染色，随后现场利用显微镜对标本进行快速评价、分流和初步诊断，以指引下一步检查操作的一项诊断技术[1]。1990年Davenport报告在气管镜活检过程中应用ROSE技术可以提高肺恶性肿瘤活检组织的合格率，从而提高疾病的诊断率[2]。运用ROSE技术除可提升活检标本的合格率外，还可减少活检次数和操作时间，且能提供早期诊断根据。最近10年，由于肺结节和肺癌、呼吸疑难病与危重症感染等早期诊治的迫切需要，以及介入呼吸病学技术广泛应用和不断更新发展，ROSE技术在呼吸介入诊疗中得到蓬勃发展，在肺、甲状腺、腮腺、胰腺和纵隔淋巴结等组织诊断中发挥了重要作用[3-16]。现对诊断性介入呼吸病学的ROSE技术研究进展进行综述。

1 ROSE的分类及其临床价值

ROSE为伴随介入技术发展起来的诊断技术，分为现场细胞学评估(cytological ROSE，C-ROSE )与现场微生物学评估(microbiological ROSE，M-ROSE)两部分，C-ROSE主要用于判断细胞良、恶性，M-ROSE主要用于微生物评价，两者密不可分[14]。C-ROSE的主要临床价值包括：(1)实时指导经气管镜支气管肺泡灌洗、经支气管镜肺活检、刷检、黏膜活检、经支气管镜细针吸引活检、经皮肺活检、胸膜活检、经胸腔镜胸膜活检，以及其他部位(如皮下或深在部位)针吸脱落细胞学等检查的开展。(2)在进行各类经气管镜介入治疗(高频电刀、氩等离子电凝、冷冻切除、光动力治疗、微波治疗、激光治疗等)过程中，指引介入呼吸病学治疗的进程和判断介入呼吸病学治疗效果。(3)经呼吸内镜确定肺部肿瘤外科手术切除范围。M-ROSE的主要临床价值包含：(1)根据形态学特征，初步辨别部分微生物病原，如念珠菌属、曲霉菌属、耶氏肺孢子菌、隐球菌和其他类型真菌、病毒包涵体、球菌和杆菌。(2)可现场实时反复取材，保证检材性标本量。(3)根据细胞分类与计数及其比例等细胞学背景，粗略区分感染性疾病和非感染性疾病，从而制定初步治疗的策略，并能够预估病情严重程度和预判疗效。

2 传统ROSE技术

ROSE可安排在手术室、呼吸内镜室、重症监护室等场所进行，不受场地限制。所需要的设备和材料比较简单，包括玻片、染液和显微镜。关键步骤是应用普通光学显微镜或荧光显微镜立刻对标本进行观察和判读，因此光学显微镜或荧光显微镜的配置是关键，还可配置高清的图文采集系统和打印设备，以利于出具报告。

ROSE操作分三步骤依序进行，首先是制片，接着是染色，最后是判读。常用的制片办法有活检组织块滚片(印片) 法、细胞刷涂抹(刷片)法、喷片法与喷射推片法、液基薄层细胞制片法、微孔滤膜过滤法等。制片时需注意厚度适中，涂片均匀。制片结束后，依据实际情况选择合适的染色方法，立刻开展快速染色。快速染色措施有很多种，现常用的快速染色方案有以下3种：(1)迪夫快速染色[17]，适用于穿刺组织、血液、体液等标本的染色。(2)极快速改良瑞氏染色，可通用于绝大多数C-ROSE与M-ROSE的染色[13]。(3)改良快速巴氏染色，一种比较常用的快速染色方法，虽然其灵敏度和特异度都较极快速改良瑞氏染色高[18]，但染色时间较久，大概为3 min，而且操作需15个步骤，相对繁杂；在C-ROSE过程中往往需要专业技师的帮助，一定程度上限制其使用[19]。其他的快速染色法[13]：极快速改良乳酸染色(改良乳酸酚棉兰染色)，主要用于判断真菌感染；快速支原体DNA霍氏荧光染色，主要应用于判断支原体感染；快速金-罗耐酸菌荧光染色(也叫金胺O-罗丹明荧光染色)，染色呈强阳性为结核分枝杆菌和努卡菌，染色呈弱阳性为军团菌；试剂盒化快速革兰染色，主要应用于判断球菌和杆菌。

染色完成后，清洗玻片，用吸水纸吸干存留玻片上的染液或水分，玻片放置于显微镜，现场在光学显微镜或荧光显微镜下观察，在最短时间内对镜下所看到的细胞形态、排列特点和周围细胞背景等进行初步认定，并迅速判读获得结果，从而根据结果指导介入操作的进程。阅片者往往需要密切结合临床资料，综合应用微生物学、影像学、细胞学、病理学等多学科知识，对标本进行判读。阅片者既可以是病理科、检验科医师，也可以是临床医师，要求其受过系统培训，并具备丰富的经验。首先判断标本是否合格：如观察到出血、坏死或黏液状的物质，有效细胞成分少，则提示取材不理想，需实时调整取材位置或取材方法，直至取材成功。若已取得理想标本则可结束操作。取材成功后根据现场快速判读结果进行标本分流，如果现场见到异形细胞，则初步判断是否为恶性细胞、可疑恶性细胞，考虑行免疫组化或肿瘤基因检查，并指导进一步取材；如现场判断化脓性病变或见到细菌吞噬，初步判断是否为感染性疾病，考虑行病原学相关检查和微生物宏基因检测。

ROSE在介入操作方面具有很多优势：(1)提高取材诊断阳性率，特别是对病灶小、取材难的病变组织；(2)减少介入操作次数，降低操作并发症发生风险；(3)对疑难和危重症患者，ROSE结果可用于指导标本的进一步处置和特殊检查，为早期诊断、早期治疗提供客观根据；(4)在多学科联合诊断技术中性价比高，有助于恶性肿瘤的诊断和标本的分流[20]，如用于快速染色的肺癌组织检材可直接用于二代基因测序[21]。ROSE除了在早期可指导区别恶性、良性病变外，在鉴别部分变态反应性疾病(如嗜酸性粒细胞性支气管炎和哮喘、嗜酸性粒细胞增多症)、呼吸系统感染性疾病(炎症细胞增多)等方面也具有重要作用。

关于传统ROSE技术的应用价值和局限性，有学者认为：ROSE操作需要操作者具备较强的细胞病理学知识储备，不应该由临床医师开展现场染色、读片判断[22]；不合格的ROSE诊断有可能导致穿刺提前结束，导致活检不成功，有研究结果显示ROSE并不能提高经支气管镜针吸活检的诊断率[23]。此外，由于受限于染色方法，且操作者经验和技术水平参差不齐，ROSE判读结果差异大。同时，操作人员快速识别形态学也有难度，存在一定的主观误差，并不能确诊，所以ROSE结果所能提供的信息也是局限的[22]。

3 免疫荧光标记染色ROSE技术

鉴于以上传统ROSE技术的不足，ROSE诊断创新(免疫荧光标记染色ROSE技术)应运而出：从ROSE操作过程中的染色方法方面寻找新的突破口，将免疫荧光染色法的理念引入、融合到传统ROSE技术中，结合其他新的介入诊疗手段，提高基于ROSE技术的呼吸介入诊断的灵敏度和特异度。《美国传染病微生物实验室诊断方法使用指南》[24]中指出，免疫荧光染色法是诊断真菌引起的血液、心血管系统、中枢神经系统、眼部、头颈部软组织、呼吸道、胃肠道、腹腔、骨和关节、泌尿道、生殖器、皮肤和软组织等的感染最为可靠的方法[24]。中华医学会病理分会第二十五次学术会议提出，抗酸分枝杆菌荧光染色法诊断儿童结核病感染的灵敏度和特异度更高。肺结核诊断行业标准WS288-2017中增加了荧光染色显微镜检查和儿童肺结核诊断特点内容[25]，能够更好地为结核感染患儿的确诊提供指导依据。荧光染色检测法用于恶性肿瘤诊断方面的研究[26-27]逐渐受到关注。传统ROSE技术流程繁多，操作复杂，且无法实现快速精确诊断。采用蛋白荧光标记技术可一步染色操作，1 min内对各类组织和细胞标本进行染色诊断。

免疫荧光染色法主要分三部分：真菌荧光染色(对各类组织和细胞标本中存在的真菌进行基础菌属分类)、抗酸荧光染色(对各类组织和细胞标本中存在的抗酸杆菌进行特异性标记)、组织细胞荧光染色(对各类细胞标本中存在的病变细胞进行快速提示，区分炎症细胞、正常非变异细胞、变异异常细胞)。荧光染色试剂包括：(1)免疫显色试剂(I型)，用于对组织和细胞标本中各类真菌进行荧光染色标记，一步染色，1 min镜下观察，根据形态进行部分菌属区分。(2)抗酸分枝杆菌检测试剂，用于对组织和细胞标本中的抗酸杆菌进行荧光染色标记，二步染色，15 min镜下观察，标本无须加热，高度背景反差极易发现抗酸分枝杆菌。(3)组织细胞染色液，用于对组织和细胞进行荧光染色标记，一步染色，1 min镜下观察，能针对细胞类型和清晰的细胞学背景进行迅速归类。荧光染色试剂无毒、无味、无挥发性，常温避光保存即可。医务人员可在荧光生物显微镜下对荧光染色后的标本进行快速判读，并现场评价。

与传统ROSE技术相比，免疫荧光标记染色ROSE技术有以下优势：(1)荧光快速染色技术操作简单，检测时间短，符合快速研判诊断、快速出报告的要求。(2)荧光显色，灵敏度高，减少漏诊发生。(3)特异性荧光标记，形态确切，特异度高，减少假阳性，临床符合率高。(4)一份标本可同时完成多种检测，减少临床反复取材，可提示真菌、结核杆菌、球菌、杆菌和异常病变细胞、炎症细胞、上皮细胞。

4 小结与展望

传统染色ROSE技术的应用推进了呼吸介入诊断技术的快速发展，免疫荧光标记染色ROSE技术也逐渐突显优势，基于免疫荧光检测方法的全自动荧光图像扫描仪(包括有单通量荧光自动型、多通量荧光自动型)可自动扫描判断，加上在人工智能医疗领域的全方位研究，实现了深度学习、计算机视觉、光电控制等开创性的技术突破。其中NGMAX采用独创的算法模型，结合自动化扫描设备，形成了一站式软硬件一体辅助诊断解决方案，用于实现呼吸道病原体和细胞学荧光下人工智能筛查与诊断，准确率突破98%，便于临床解决更多的疑难杂症和新的诊断技术挑战。自动化制片与自动化染色的研究目前正在开展中，不久的将来，随着人工智能技术的快速发展，有望实现ROSE技术全自动化，推进ROSE技术应用的飞跃变革。