MiRNA在增生性瘢痕和纤维化疾病中的作用研究进展▲

李文涛 徐明鹏 黎雨 谭小玉 檀森 柳广南

广西医科大学第二附属医院呼吸与危重症医学科，南宁市 530007

【提要】 微小核糖核酸(miRNA)是高度保守的内源性非编码单链小分子RNA，广泛调控靶基因表达，在细胞生长、增殖、凋亡、分化,以及机体代谢等一系列生命过程中发挥着重要作用。近年来，miRNA已成为诊断和治疗增生性瘢痕、纤维化疾病的研究热点，有望成为高特异性生物标志物、评估疗效的新靶标，更从分子机制上为揭示疾病的发生发展提供一种全新的思路和方向。现将miRNA在皮肤瘢痕、气管瘢痕、心肺肝肾纤维化疾病中的研究进展介绍如下。

增生性瘢痕是在各种致伤因素作用下，损伤创面在愈合过程发生的病理性修复，涉及一系列炎症反应、细胞分化增殖、胞外基质堆积和组织结构重建等复杂病理生理改变，表现为以成纤维细胞为主的效应细胞过度增殖和以Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白为主的细胞外基质大量沉积[1]。纤维化可发生于多种脏器中，在致病因素刺激下，正常组织细胞萎缩、凋亡或异常死亡后，被过度增殖的成纤维细胞所替代，形成排列紊乱的胶原纤维，产生大量细胞外基质堆积，导致器官结构、功能异常[2]。因此，瘢痕和纤维化属于同一种病理过程，其根本核心实质是损伤-修复失衡，组织修复过度或失控导致结缔组织和胶原纤维增生，瘢痕、纤维化形成，持续进展可致组织器官结构破坏、功能衰竭。目前皮肤瘢痕[3-4]、气管瘢痕[5-6]、心肺肝肾纤维化[7-10]疾病是临床治疗上一大难题，其致死率、致残率逐年上升，严重威胁人类健康和生命。如何抑制或逆转器官瘢痕、纤维化的形成是当今医学研究的重要课题。

微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是高度保守的内源性非编码单链小分子RNA，直接结合靶基因mRNA 3′UTR，从而抑制或降解mRNA转录翻译，广泛调控靶基因表达，在细胞生长、增殖、凋亡、分化，以及机体代谢等过程中发挥着重要作用[11-12]。近年来，随着高通量测序技术、生物信息学的迅猛发展，深入认识非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)后发现miRNA不仅与多种增生性瘢痕和纤维化疾病的发生、发展密切相关，同时还在疾病治疗中表现出巨大潜力，成为研发抗瘢痕增生、纤维化形成药物的新靶点[13-14]。现将miRNA在皮肤瘢痕、气管瘢痕、心肺肝肾纤维化疾病中的作用研究进展介绍如下。

1 MiRNA的概述

MiRNA是一类长约18～25个核苷酸的非编码单链小分子RNA。1993年，Lee等[15]在研究线虫早期发育的实验中，应用定位克隆法发现第一个不编码蛋白质的miRNA，即Lin-4，作为负性调节因子参与线虫发育。2002年，Science杂志把miRNA的发现评为十大科技突破之首。随着越来越多的功能miRNA被发现，miRNA和mRNA之间交互分子效应作用成为研究热点，标志着一个基因调控新领域的到来[16]。据推测人类基因组中大约有50%的DNA可转录为RNA，仅有2%左右的RNA参与蛋白质翻译，其中4 000多个miRNA调控60%的基因转录，即1个miRNA可调控200多个靶基因，而1个mRNA也可受多个miRNA调节，形成复杂的调控网络[17-18]。miRNA由于在人体血清、组织和其他体液中均有表达，且表达相对稳定、时效较长，故其有望成为疾病高特异度、高灵敏度的生物标志物，并可用于监测疾病进展和疗效评价。

2 MiRNA在增生性瘢痕中的作用

2.1 MiRNA与皮肤瘢痕 皮肤瘢痕是研究最为广泛的增生性瘢痕之一，是整形外科、皮肤科一直以来面临的棘手问题。创伤后皮肤愈合修复，结缔组织异常增生，突出皮肤表面，且质地实韧，向周围正常皮肤侵袭性生长，具有类似肿瘤的生物学特性，因此又被称为“瘢痕瘤”。Guo等[19]采用微阵列分析正常皮肤和皮肤瘢痕组织差异miRNA表达，发现两种组织间有152个miRNA表达存在差异，其中82个呈上调表达、70个呈下调表达。Li等[20]在皮肤瘢痕组织中鉴定出：miR152、miR23b-3p、miR31-5p、miR320c、miR30a-5p和miR-H7呈显著上调表达，miR4328、miR145-5p、miR143-3p呈显著下调表达，对其靶基因进行预测和富集分析后发现，上述miRNA主要富集在转化生长因子-β和丝裂原活化蛋白激酶信号通路、细胞凋亡和细胞周期的调控。

皮肤瘢痕形成经历炎症期、肉芽组织增生期、瘢痕修复期三个阶段，无论哪个阶段出现调控失衡，均可发生病理性修复，形成增生性瘢痕。miRNA几乎参与了以上每个阶段，其主要调控炎症因子、细胞因子释放，通过转化生长因子-β1，人第10号染色体缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶(protein kinase B,AKT)等信号通路，改变成纤维细胞、角质形成细胞、肌成纤维细胞过度增殖、分化、迁移、凋亡，以及上皮细胞间充质转化(epithelial-mesenchymal transdifferentiation，EMT)等生物学功能，加剧细胞外基质堆积，最终形成瘢痕。Naqvi等[21]研究发现，上调miRNA-24、miRNA142-3p、miRNA-30b表达后，炎症因子肿瘤坏死因子-α、白细胞介素(interleukin，IL)-6和IL-12 p40的合成和释放受到抑制，并且大大减弱单核细胞、巨噬细胞对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的吞噬作用，从而减轻炎症反应。Li等[22]在转化生长因子-β1诱导皮肤瘢痕成纤维细胞的研究中发现，胶质瘢痕组织和成纤维细胞中的miRNA-21、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白表达显著上调，而Smad7表达受到抑制，此结果提示：miRNA-21可能抑制Smad7表达，激活转化生长因子-β1/miRNA-21/Smad7信号通路，最后促进细胞外基质合成。Yan等[23]转染miRNA21-5p模拟物到角质形成细胞后发现：miRNA21-5p上调表达促进角质形成细胞增殖、迁移、侵袭，同时vimentin和snail2表达上调、E-cadherin表达下调，由此推测：miRNA21-5p通过PTEN/AKT信号通路影响角质形成细胞的生物学功能并调控EMT表型。因此，有学者[19]用miRNA-21拮抗剂阻断皮肤瘢痕成纤维细胞miRNA-21表达后发现，成纤维细胞生长、增殖受到抑制，成纤维细胞的凋亡加速，纤维化相关基因的表达减少，以及胶原蛋白等细胞外基质的沉积；且其进行动物实验后发现，miRNA-21拮抗剂还可显著地改善兔耳瘢痕的严重程度、减少胶原蛋白沉积，说明下调miRNA-21对治疗兔耳增生性瘢痕具有良好疗效，这为皮肤瘢痕的治疗提供新的分子靶标。

2.2 MiRNA与气管瘢痕 在致病因素作用下气管受到损伤后，经过一系列病理性修复、瘢痕形成，最终导致气管狭窄，常以呼吸困难为主要临床表现，严重者出现窒息进而危及生命。气管结核、气管插管或气管切开是气管瘢痕狭窄的主要原因；热消融术、冷冻术、球囊扩张和支架置入术等呼吸介入治疗，或者胸外科的狭窄段气管切除并端端吻合治疗，这些内科介入治疗和外科手术治疗，都可对气管造成二次损伤，患者术后仍可发生气道再狭窄[24]。目前国内外关于良性气管狭窄相关研究大多集中在病例报告和诊疗方法上，对其涉及的发病机制探索甚少[25]。近年来随着科学技术水平不断提高，miRNA与气管瘢痕狭窄的相关性研究逐渐受到关注。叶乃郗等[26]应用基因芯片技术检测8例良性气管瘢痕狭窄患者的气管狭窄瘢痕组织和正常气管黏膜组织中miRNA127-3p表达水平后发现：气管瘢痕狭窄组织中miRNA127-3p呈显著低表达；miRNA127-3p过表达可下调丝裂原活化蛋白激酶4表达，抑制气道瘢痕成纤维细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和α-平滑肌肌动蛋白表达，影响成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，最终可抑制气管瘢痕增生。王新[27]使用生物信息学技术对Gene Expression Omnibus数据库和ArrayExpress数据库中174个肺纤维化样本进行分析后发现，纤维化肺组织中miRNA320a-3p呈下调表达，临床实验证实miRNA320a-3p在气管瘢痕组织中亦呈低表达，进一步行功能及分子实验后发现miRNA320a-3p可通过下调STAT3，调控转化生长因子-β1诱导气管上皮细胞增殖、迁移及EMT作用。

3 MiRNA在纤维化疾病中的作用

3.1 MiRNA与心肌纤维化 心肌纤维化是指正常心肌组织细胞萎缩、凋亡或异常死亡后，在炎症、氧化应激等因素刺激下，成纤维细胞过度增殖并向肌成纤维细胞转化，促使细胞外基质过度堆积、心肌间质重构的现象，是诱发心律失常和心功能衰竭等严重并发症的主要原因之一[28]。研究[29]表明：各种原因导致的心肌纤维化都伴随着一系列特定miRNA的表达变化。Yu等[30]在用血管紧张素Ⅱ诱导大鼠心脏成纤维细胞纤维化的体外实验中观察到miRNA99b-3p表达显著上调。转染miRNA99b-3p模拟物至心脏成纤维细胞后，纤连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白分泌增加，促进成纤维细胞增殖和迁移，可能通过调控糖原合成酶激酶-3β的表达，导致其下游促纤维化效应因子Smad3激活，促使心肌细胞纤维化。另一项研究[31]结果显示，miRNA-214表达水平与心肌纤维化严重程度呈负相关。在大鼠心腔注射miRNA-214前体和抑制剂来调节心肌miRNA-214的表达，结果显示：miRNA-214可下调基质金属蛋白酶-1，Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白，以及转化生长因子-β1的表达，减轻心肌细胞外基质堆积、胶原蛋白错乱排序，抑制心肌重塑，具有保护心肌的作用。Thum等[32]研究证实：miRNA-21可以下调Spry1表达，激活细胞外信号调控的蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)/丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路，促进心肌成纤维细胞活化并释放大量生长因子。进一步动物实验发现：沉默miRNA-21后，心脏ERK/MAPK酶活性降低，心脏间质纤维化受到抑制，且心脏功能障碍有所减轻。因此，miRNA-21有望成为治疗心肌纤维化的潜在新靶标。

3.2 MiRNA与肺纤维化 肺纤维化是以肺泡上皮细胞损伤、炎性细胞浸润、上皮-间质转化、纤维细胞增生转化、细胞外基质沉积、最终纤维化形成为特征的一种进行性呼吸困难的间质性肺疾病。研究表明，miRNA在肺纤维化的发生发展中发挥重要作用。Wang等[33]通过辐射诱导肺纤维化发现在纤维化的肺组织中miRNA155-5p表达下调，且其表达水平与肺纤维化的形成呈负相关。敲除miRNA155-5p的功能靶基因糖原合酶激酶-3β，可增强p65(核因子κB 的亚基)的磷酸化，逆转EMT作用，这说明：下调miRNA155-5p介导糖原合酶激酶-3β/核因子κB信号传导有助于减轻小鼠肺纤维化。在一项博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型研究中[34]，肺纤维化小鼠的肺组织中miRNA-21表达显著上调，从博来霉素给药第3天开始肺组织中miRNA-21上调表达，在给药第14天达到最高水平，并持续呈高表达24 d天以上，说明miRNA-21上调表达参与肺纤维化的整个过程。进一步进行分子实验后发现，miRNA-21可能下调Smad7、Spry1、PTEN表达，影响转化生长因子-β1/Smad、ERK、FAK/AKT信号通路，促使成纤维细胞向肌成纤维细胞转化、增殖、迁移、侵袭，增强胶原蛋白、基质金属蛋白酶分泌与堆积，最终导致不可逆的肺纤维化[34]。相反，纤维化肺组织中miRNA-29b呈低表达，可以减轻博莱霉素诱导的纤维化和炎症反应，降低胶原蛋白表达，改善小鼠肺纤维化[35]。从以上研究中，我们发现miRNA通过调控编码基因的表达，发挥促纤维化或抗纤维化作用，可能成为治疗肺纤维化的新方法。同时，miRNA可以与非编码基因中环状RNA(circular RNA，circRNA)、长链ncRNA(long ncRNA, lncRNA)相互作用。Li等[36]发现：miRNA29b-2-5p 是circ949、circ057和lnc865、lnc556 直接靶向的miRNA，而miRNA29b-2-5p结合STAT3，可影响STAT3磷酸化，抑制转化生长因子-β1诱导成纤维细胞增殖、迁移和EMT作用。因此circ949、circ057和lnc865、lnc556与miRNA29b-2-5p形成复杂而庞大的竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)调控网络，彼此相互作用，在转录层面上调控SRAT3表达，参与肺纤维化的进程。

3.3 MiRNA与肝纤维化 肝纤维化是指在病毒、酒精、自身免疫、寄生虫等致病因素作用下，肝星状细胞过度增殖，造成肝内结缔组织异常增生、弥漫性细胞外基质过度堆积，导致肝脏结构和功能异常的病理过程。miRNA在肝纤维化发病机制中起着重要作用[37]：miRNA-942在活化肝星状细胞中呈高表达，且在慢性乙型肝炎患者中，miRNA-942表达随肝纤维化的进展而增加，这提示miRNA-942可以作为一种评估肝纤维化分级的生物标志物。同时，miRNA-942可与过氧化物酶体增生物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)γ 3′UTR直接结合，过表达或敲除miRNA-942后，相应抑制或促进PPARγ的表达。这提示，miRNA-942可能通过抑制PPARγ表达促进肝星状细胞活化，或可成为肝纤维化重要治疗靶点。另一项研究[38]采用定量实时PCR法检测150例丙肝患者和50名健康人群血清miRNA-21、miRNA-199、miRNA-448和miRNA-181c表达水平后发现：丙肝患者血清miRNA-21、miRNA-199、miRNA-448和miRNA-181c水平与健康人群相比有差异；在肝纤维化晚期丙肝患者中，血清miRNA-199表达显著上调、miRNA-448表达显著下调。这提示miRNA-199和miRNA-448可作为监测肝纤维化进展的生物标志物。此外，孙浩男等[39]指出：lncRNA Malat1可与miRNA-195结合，miRNA-195可与Smad7结合。进一步研究后证实：lncRNA Malat1可上调miRNA-195表达，影响Smad7表达，减弱Smad7对转化生长因子-β1/Smads信号通路抑制作用，从而促进肝星状细胞的活化、增殖。这说明miRNA-195与lncRNA Malat1和靶基因Smad7之间形成ceRNA，参与肝纤维化。

3.4 MiRNA与肾纤维化 肾纤维化是指受损肾组织被过度增殖和分化的成纤维细胞代替的一种病理改变。miRNA的发现为评估与治疗肾纤维化提供全新视角。Chandrasekaran等[40]研究发现：miRNA-146a、miRNA-192d、miRNA-215的表达在肾组织中较在其他组织中显著上调，其中miRNA-192d在肾皮质中的表达水平是肾髓质中的20倍。Bai等[41]使用单侧输尿管梗阻诱导小鼠肾纤维化后发现： 使miRNA27b-3p过表达后，平滑肌肌动蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、纤连蛋白、纤维连接蛋白、Fas、caspase 8、caspase 3表达下降。双荧光素酶实验发现miRNA27b-3p与STAT1 3′非编码区存在互补序列，两者结合后，STAT1表达下调。由此可知：miRNA27b-3p可通过下调STAT1、平滑肌肌动蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的表达减轻小鼠单侧输尿管梗阻导致的肾纤维化作用。Bao等[42]研究发现：抑制miRNA-21表达可通过阻断PTEN/AKT信号通路阻止免疫球蛋白A肾病患者足细胞和肾小管细胞纤维化，从而逆转免疫球蛋白A肾病的进展。

4 总结与展望

综上所述，miRNA是高度保守的非编码单链RNA分子，在转录后水平调控靶基因表达，参与细胞增殖、凋亡、分化，以及机体代谢等生命过程。目前miRNA在诊断和治疗皮肤瘢痕、气管瘢痕等增生性瘢痕和心肺肝肾纤维化疾病中取得巨大进步，有望成为高特异性生物标志物和评估疗效新靶标。但研究亦表明，miRNA的表达具有组织功能特异性、个体发育时序性的差异，而调控的基因不同，作用机理不同，导致miRNA的生物功能不同，且其与非编码 lncRNA、circRNA之间相互作用形成复杂的调控网络，这些均给miRNA的研究带来更多的挑战。因此，研究miRNA时应根据其在不同细胞、组织层面，以及个体所处的发育不同阶段，从多个层面和维度全面地揭示miRNA复杂的网络调控机制，为研究疾病的发生和发展提供一种新的方向和思路。