口疳散穴位贴敷的制备工艺及体外透皮吸收研究*

李 清，周秋娟，瞿发林**，陈 颖，董文遷，楼欣誉

1 中国人民解放军联勤保障部队第九〇四医院，常州 213003；2 常州市武进区中西结合医院，常州 213003；3 常州卫生高等职业技术学校，常州 213003

口疳散穴位贴敷为本院中医师自拟方，方中吴茱萸、细辛、生大黄、川黄连、肉桂研粉、以醋调匀，搓制成直径1 cm 左右药球，贴于双足底涌泉穴，夜敷昼去，以治口疮疗效显著。其中吴茱萸、细辛、肉桂为温里药，滋阴降火，导热下行；大黄、黄连味苦性寒，清热泻火，用于上焦实火去炎。吴茱萸在本方中占比最大，其所含的主要成分是以吴茱萸碱为代表的生物碱类[1]，具有一定的透皮吸收性[2]。故本研究以吴茱萸碱为指标成分，对不同制备工艺的口疳散穴位贴敷中吴茱萸碱的透皮吸收效果进行比较，为穴位贴敷制备工艺的优化提供参考依据。

1 实验材料

1.1 主要仪器

TP-2A 型智能药物透皮仪（河南佰泽仪器设备有限公司）；Waters2467 高效液相色谱仪（515 HPLC Pump 泵，Waters CapLC2487 双λ 吸光度检测器，Empower2 数据处理系统，美国Waters 公司）；FA1004型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

吴茱萸碱对照品（南京世洲生物科技有限公司，纯度：98%，批号：201901WZYJ）；大黄（批号：180923）、黄连片（批号：181221）、肉桂（批号：180807）、制吴茱萸（批号：181118）、细辛（批号：181118），均购自江苏华洪药业科技有限公司；聚乙二醇400（国药集团化学试剂有限公司，批号：20190806）；月桂氮卓酮（湖北科捷制药有限公司，批号：181103）；甲醇为色谱纯；白醋、生理盐水为市售品；乙腈为色谱纯；乙醇为药用级；水为纯化水。

1.3 实验动物

SPF 级BALB/c 小鼠10 只，雄性，质量（20±2）g（上海西普尔-必凯实验动物有限公司）；动物合格证号：SCXK（沪）2018-0006。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Lichrospher C18（150×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（50∶50）；检测波长：225 nm；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液精密称取吴茱萸碱对照品4.85 mg，置50 mL 量瓶中，用甲醇溶解，定容，摇匀，即得吴茱萸碱对照品储备液（95.06 μg·mL-1）；取该溶按一定比例甲醇稀释得对照品溶液。

2.2.2 实验溶液①供试品透皮接收溶液：生理盐水-乙醇-聚乙二醇400（6∶3∶1）；②透皮吸收样液：在规定的时间内从接受池中精密取样1.0mL，用0.45μm的滤膜过滤，续滤液作为供试品溶液；③皮肤滞留药物样液：24 h 体外透皮吸收实验结束后，将皮肤取出，用新鲜接收液清洗表面残留物，再用生理盐水清洗干净，用滤纸将其吸干，把有效渗透皮肤剪下并将其剪碎，加入1.0 mL 甲醇，称定质量，超声提取2 次，每次30 min，用甲醇补足失重后取上清液，用0.45 μm 滤膜过滤，即得。

2.3 实验分组

本实验使用的药材粉末分为两种：一种是100目普通粉；另一种是500 目超微粉。实验共分为7组。超微粉与普通组：分别将药材的超微粉或普通粉按处方比例混匀后，加入适量的白醋调和成糊状；水调和组：将药材的超微粉按处方比例混匀后，加入适量的纯化水调和成糊状；不同比例氮酮组：将药材的超微粉按处方比例混匀后，分别加入不同浓度氮酮（1%、3%、5%），加入适量的白醋调和成糊状；阴性对照组：不含吴茱萸药材的超微粉，按处方比例混匀，加适量白醋调和成糊状。

2.4 专属性考察

分别将对照品溶液、供试品透皮接收溶液和阴性样品溶液按“2.1”项下色谱条件进样分析，结果表明，吴茱萸碱与相邻色谱峰的分离度均＞1.5，阴性样品溶液对测定无干扰，该方法专属性良好。见图1。

图1 吴茱萸碱的HPLC 图

2.5 线性关系考察

取对照品贮备液按一定比例甲醇稀释，得浓度分别为95.06、9.51、1.90、0.19、0.04、0.02 μg·mL-1系列对照溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。以浓度（μg·mL-1）为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得出回归方程为：

Y=225 769X+51 885，r=0.999 9；表明吴茱萸碱在0.02～95.06 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验

精密吸取对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样20 μL，重复进样6 次，记录峰面积，计算得相对标准偏差（RSD）为2.00%，表明仪器的精密度良好。

2.7 稳定性试验

取同一时间的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0、3、6、9、12、18、24 h 进样，测定峰面积，计算RSD 为1.68%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.8 回收率试验

精密量取适量空白透皮接收液6 份，分别加入适量的吴茱萸碱对照品溶液，混匀后用0.45 μm 微孔滤膜过滤，续滤液按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率为98.40%，RSD 为1.79%。

2.9 体外透皮吸收实验

2.9.1 离体鼠皮的制备将健康裸鼠脱臼处死后，小心剥离腹部皮肤；去除脂肪以及皮下组织，用生理盐水洗净，置于-20 ℃冰箱储存[3]，使用前自然解冻，生理盐水浸泡30 min，滤纸吸干后备用。

2.9.2 实验过程采用改良Franz 扩散池为透皮扩散装置：接受池体积为18 mL，接受面积为1.23 cm2，接受液为生理盐水-乙醇-聚乙二醇400（6∶3∶1）。取3 份已经处理好的裸鼠皮肤，裁剪成适当大小，固定于接受池与供给池之间，皮肤角质层面向供给池。在接受池中注满接受液，转速300 r·min-1，水浴温度为（37±1）℃，排尽气泡，平衡0.5 h。然后在供给池中分别加入0.65 g 按处方调制好的糊状样品并取不透光的纸箱，盖住透皮扩散装置，以达到避光效果。在1、2、4、8、12、24 h 从接收池中取样1 mL，同时加入1 mL 的新鲜等温接受液。将取出的溶液用0.45 μm的滤膜过滤，取续滤液，即供试品透皮接受溶液。24 h 之后，将皮肤小心拿下，依据“2.2.2”项下的方法完成皮肤滞留药物样品。将之前得到的供试品透皮接受溶液以及后续制作的滞留药物样品，按照“2.1”项下色谱条件进行吴茱萸碱的含量测定，并计算其累积透皮量[4]。

3 实验结果

药物的累积透皮量Qn可通过式（1）进行计算：

Cn为第n 个取样点测得的药物质量浓度（μg·mL-1）；Ci为第i 个取样点测得的药物质量浓度（μg·mL-1）；V 为接受液体积；Vi为取样体积；S 为有效渗透面积[5]。以药物的Qn（μg·cm-2）对取样时间t（h）作曲线，并通过公式（2）对曲线中直线部分进行线性回归，求得直线斜率，即为稳态透皮速率Js（μg·cm-2·h-1）。

皮肤的药物滞留量Qs（μg·cm-2）可按式（3）计算[6]：

A 为有效面积，V 为提取液的体积，C 为得到的药物质量浓度。

不同制备工艺的口疳散穴位贴敷，在体外透皮实验的接收液中均检测到了吴茱萸碱成分，各组吴茱萸碱的24 h 累积透皮量（Q24）如图2 所示，其中超微粉组（5.43±0.17）μg·cm-2与普通粉组（3.71±0.10）μg·cm-2相比较，吴茱萸碱的Q24显著性增加（P＜0.01）；水调和组（3.22±0.22）μg·cm-2与超微粉组相比，吴茱萸碱的Q24减少有统计学显著意义（P＜0.001）；而加入了促透皮吸收剂氮酮的3 组实验结果与超微粉组相比较，只有3%氮酮组（6.35±0.52）μg·cm-2的吴茱萸碱Q24增加有统计学意义（P＜0.05），各组的吴茱萸碱体外透皮吸收曲线、Q-t 拟合曲线和稳态透皮速率Js分别见图3 和表1。

表1 口疳散穴位贴敷中吴茱萸碱的体外透皮吸收Q-t 拟合曲线和稳态透皮速率Js

图2 口疳散穴位贴敷中吴茱萸碱的24 h 体外累积透皮量（，n=3）

图3 口疳散穴位贴敷中吴茱萸碱的体外透皮吸收曲线

皮肤滞留量的检测结果见图4。吴茱萸碱的Qs在普通粉组（0.55±0.06）μg·cm-2与超微粉组（0.60±0.12）μg·cm-2相比较，无明显差异；水调和组（0.25±0.08）μg·cm-2与超微粉组相比，吴茱萸碱的Qs出现显著性减少（P＜0.05）；而加入了促透皮吸收剂氮酮的3 组实验结果与超微粉组相比较，只有5%氮酮组（0.31±0.07）μg·cm-2的吴茱萸碱Qs有明显减少（P＜0.05），1%组（0.54±0.15）μg·cm-2和3%组（0.69±0.02）μg·cm-2均无显著性差异。

图4 疳散穴位贴敷中吴茱萸碱的皮肤滞留量（，n=3）

4 讨论

穴位贴敷疗法既可以刺激穴位，又可以通过有效成分的透皮吸收而发挥显著的药理作用，因此具有较好的治疗效果[7]。将口疳散穴位贴敷粘贴到足底涌泉穴，通过上病下治的机理，以达到治疗口疮病的目的。上病下治法是以中医的整体观念为前提，将疾病的病因病机、脏腑经络辨证以及气机升降调节相结合而确立的治疗原则，辨证论治、治病求本[8]。

通过透皮吸收实验，测定不同制备工艺的口疳散穴位贴敷中吴茱萸碱透皮吸收量，从而对其制备工艺进行研究。在预实验中，未能在接收液中成功检测到吴茱萸碱，分析原因可能是透皮后的吴茱萸碱不稳定，对光敏感，易被破坏，故在正式试验的全过程中采用避光处理，从而准确测得接收液中吴茱萸碱的含量。由实验结果可知，药材饮片经过超微粉碎后，粒径约为25 μm 与粒径为150～200 μm 普通粉碎的药材相比，其制得的口疳散穴位贴敷中吴茱萸碱Q24显著性增加。分别使用醋和水调和超微粉、其配制的穴位贴敷中吴茱萸碱Q24也出现显著性差异，醋调和组的吴茱萸碱Q24要明显高于水调和组，表明醋对于口疳散穴位贴敷的疗效发挥了重要作用。另外，两者皮肤滞留量的实验结果表明，醋调和组的吴茱萸碱皮肤滞留量也明显高于水调和组。可能是因为醋与药材中的吴茱萸碱等有效成分结合形成盐，不仅使溶解度增加，使其从药材中游离出来，且组成带正电荷水溶液，更易于透过皮肤[9]。本研究还对促透皮吸收剂用量进行实验（1%、3%、5%氮酮），探讨其对体外透皮吸收的影响，从实验结果看出，只有3%氮酮的吴茱萸碱Q24出现显著性增加，5%氮酮的吴茱萸碱Q24以及皮肤滞留量甚至比不加入促透皮吸收剂还低。可见加入适量促透皮吸收剂对贴敷的体外吸收有一定的促进作用；但若用量过多，其透皮效果适得其反。考虑到醋酸能促进口疳散穴位贴敷有效成分的透皮吸收作用，宜优先选择酸性的促透皮吸收剂，如油酸。在本研究中，探讨了不同制备工艺对口疳散穴位贴敷中的吴茱萸碱透皮吸收的影响，为进一步开发该制剂提供了实验基础。