拮抗菌DG1的鉴定及其对大白菜菌核病菌的抑制作用研究

雷娟利 岳智臣 陶 鹏 赵彦婷 李必元

(浙江省农业科学院蔬菜研究所, 浙江 杭州 310021)

大白菜菌核病是由核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)引起的真菌性病害，是危害大白菜的主要病害之一，在我国各地均有发生[1]。大白菜菌核病在大白菜各生育期及储藏期均可为害，但尤其以种株开花、抽薹、结荚期为害最为严重[2]。近年来，随着保护地的发展，大白菜菌核病发生越来越普遍。

在作物病虫害防治方面，传统农业中化学农药的过量使用不仅会增加生产成本，还会造成农作物农药残留，导致作物病虫害产生抗药性，并对土壤、水体及生态环境造成污染。随着社会的进步，人们生活水平的提高，对食品安全及环境保护意识的不断加强，应用高效、广谱、安全、无毒的有益微生物进行植物病虫害防治越来越受到重视[3-6]。土壤放射杆菌K84菌株是目前应用最广泛的一类拮抗菌，能够有效预防植物冠瘿病[3]。

在分离大白菜菌核病菌的过程中，本研究前期筛选到一株核盘菌的拮抗菌DG1，通过菌落形态、生理生化指标及16S rDNA序列鉴定其类别，并研究其对大白菜菌核病菌的抑制作用，以期为大白菜菌核病及其他作物病害的生物防治提供优良的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

拮抗菌DG1在分离大白菜菌核病菌时得到，现保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M2018236。大白菜菌核病菌(S.sclerotiorum)由浙江省农业科学院蔬菜研究所大白菜甘蓝研究室分离保藏。番茄枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、番茄黑斑病菌(Alternariaalternate)和花椰菜黑斑病菌(A.alternate)分别由浙江省农业科学院蔬菜研究所番茄辣椒育种研究室和花椰菜青花菜研究室提供。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar, PDA)制做方法：将马铃薯去皮，称取200 g切块，加1 L水煮30 min后，四层纱布过滤，滤液加葡萄糖20 g、琼脂粉20 g搅拌均匀，加蒸馏水定容至1 000 mL，分装后高温灭菌待用；马铃薯葡萄糖(potato dextrose, PD)液体培养基制作方法同PDA固体培养基，但不添加琼脂粉。

1.2 菌株DG1的形态观察、生理生化指标鉴定及16S rDNA扩增

参照《伯杰氏细菌鉴定手册》中的方法对菌株DG1进行形态观察及生理生化指标鉴定，按照常规细菌学方法进行鉴定[7]。

拮抗菌DG1的16S rDNA扩增采用菌种鉴定通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，拮抗菌DG1基因组DNA的提取采用上海生工的微生物基因组提取试剂盒,具体PCR扩增步骤和体系参照雷娟利等[8]的方法。16S rRNA基因PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列，测定序列提交至GenBank数据库,序列的相似性比对采用NCBI的Blast软件与GenBank数据库中的已知序列进行比对，DG1的16S rDNA基因的系统发育树采用Mega 5.1软件构建。

1.3 菌株DG1发酵液对大白菜菌核病菌菌丝生长的抑制作用测定

DG1发酵液的制备：将菌株接种于含有10 mL PD液体培养基的50 mL离心管中，于28℃、180 r·min-1恒温摇床培养2 d,然后将发酵液于4℃、10 000×g条件下离心10 min后收集上清液，上清液经微孔滤膜过滤除菌后即为DG1发酵液。

DG1发酵液对大白菜菌核病菌菌丝生长的影响，共设3个处理：处理1为对照(CK)PD液体培养基300 μL；处理2为150 μL发酵液+150 μL PD液体培养基；处理3为300 μL发酵液。每处理设3次重复，分别均匀涂布于PDA培养基上，然后用5 mm的打孔器在大白菜菌核病菌的菌落边缘打取菌饼，将其接种于已涂布好的PDA培养基平板中央，在28℃条件下培养72 h后，分别量取菌落直径，计算抑制率：

抑制率=(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/

对照组菌落直径×100%。

1.4 菌株DG1对几种蔬菜病原真菌的抑制作用测定

在PDA平板中心位置分别接种番茄枯萎病菌、番茄黑斑病菌和花椰菜黑斑病菌菌丝块，在离菌20 mm处用灭菌牙签点接DG1菌株，置于28℃恒温培养5 d后，调查抑菌带大小，3次重复，每次重复3个培养皿。

1.5 菌株DG1挥发性物质对大白菜菌核病菌菌丝生长的抑制作用测定

参照宗英等[9]的方法，在活化后的大白菜菌核病菌边缘用直径5 mm的打孔器打取菌饼，将菌饼接种在PDA培养基平板中间。将活化后的DG1在PDA培养基平板上划线，然后将两平板对扣，封口膜密封，28℃恒温培养3 d，观察病原菌株的生长情况并测量其直径，每个处理设3个重复。以空白的PDA培养基作为对照组，按照公式计算抑制率:

抑制率=(对照组真菌菌落直径-处理组真菌菌落

直径)/对照组真菌菌落直径×100%。

1.6 菌株DG1发酵液对大白菜菌核病菌体外防治测定

取大小一致的大白菜叶片，以中脉为界，在叶片正/反面的左侧用毛笔涂无菌PD液体培养基作为对照，在叶片正/反面的右侧用毛笔涂拮抗菌发酵液作为处理，分别接种活化后的大白菜菌核病菌菌丝块，在温度22～25℃、湿度85%以上条件下培养，接种后3～4 d统计病斑大小。按照公式计算防治效果：

防治效果=(对照组病斑直径-处理组病斑直径)/

对照组病斑直径×100%。

1.7 数据分析

所有数据的统计及分析均采用Excel 2007软件完成，并选用单因素法进行方差分析及显著性分析。

2 结果与分析

2.1 菌株DG1的发现

在分离大白菜菌核病菌的过程中，发现了一株对大白菜菌核病菌具有拮抗作用的拮抗菌，并将其命名为DG1。进一步平板对峙实验证实了菌株DG1对大白菜菌核病菌的拮抗作用(图1)。

注：A1、A2为DG1；B1、B2为对照。Note: A1,A2 for DG1. B1,B2 for control.图1 平板对峙实验结果Fig.1 Results of plate antagonism experiment

2.2 菌株DG1的鉴定结果

参照《伯杰氏系统细菌学手册》[7]的方法，对菌株DG1进行了形态学观察和生理生化鉴定。结果表明，菌株DG1为革兰氏阳性需氧菌，菌体呈杆状，大小约为(0.5～0.7)μm×(2.0～3.0) μm，菌落形态为圆形、微凸、边缘整齐，菌落颜色为奶白色。菌株DG1生理生化特征鉴定共进行了20项酶活、碳源同化指标检测(结果见表1)，49项利用碳源产酸指标检测(结果见表2)。在20项酶活、碳源同化指标中共有8项呈阳性，4项呈弱阳性，8项呈阴性；在49项利用碳源产酸指标中有22项呈阳性，2项呈弱阳性，25项呈阴性。基于测定结果数据，通过API鉴定系统将菌株DG1初步鉴定为克里布所类芽孢杆菌(Paenibacilluskribbensis)[10]。

同时，将扩增出的16S rDNA条带进行DNA测序，测序结果提交至GenBank(序列登记号: MH351014)。采用BLAST进行序列同源性比较，菌株DG1基于16S rRNA基因序列比对结果以Thermobacillusxylanilyticus(AJ005795.1)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树见图4。根据同种细菌16S rDNA同源性不低于98.65%的标准[11]，结合系统发育树，菌株DG1最终被鉴定为克里布所类芽孢杆菌(P.kribbensis)。

图2 菌株DG1显微镜(1 000×)观察照片Fig.2 Microscopic observation of strain DG1 (1 000×)

图3 菌株DG1的平板菌落形态Fig.3 Plate colony morphology of strain DG1

表1 菌株DG1酶活、碳源同化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain DG1-enzyme activity, carbon source assimilation

表2 菌株DG1利用碳源产酸生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain DG1 usinGCarbon source to produce acid

2.3 DG1对4种不同蔬菜病原真菌的抑制作用

由图5可知，菌株DG1对4种蔬菜病原真菌均具有不同程度的抑制作用，其中对大白菜菌核病菌的抑制用最强，抑菌带宽度达到9.5 mm；其次为花椰菜黑斑病菌和番茄黑斑病菌，抑菌带宽度分别为9.3和7.0 mm；抑制作用最弱的是番茄枯萎病菌，抑菌宽带仅为3 mm。

2.4 菌株DG1发酵液对大白菜菌核病菌菌丝生长的抑制作用

由表3可知，菌株DG1发酵液对大白菜菌核病菌菌丝生长具有抑制作用，且抑制作用随发酵液浓度的增加而增加。每个培养皿添加150 μL发酵液时，抑制率为19.4%，当每个培养皿加300 μL发酵液时，抑制率增加到42.9%。

表3 菌株DG1发酵液对大白菜菌核病菌菌丝生长的影响Table 3 Effect of DG1 fermentation broth on mycelia growth of S. sclerotiorum

图4 菌株DG1基于16S rDNA基因序列比对结果构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of DG1 based on the sequence alignment of 16S rDNAGene

2.5 DG1产生的挥发性物质对大白菜菌核病菌菌丝生长的抑制作用

通过平板对峙实验证实菌株DG1产生的挥发性物质对大白菜菌核病菌菌丝生长具有抑制作用，抑制率为49.7%，抑制效果如图6。

2.6 DG1发酵液对大白菜菌核病体外预防效果

经过3次试验发现，无论是接种叶正面或背面，拮抗菌DG1发酵液对大白菜菌核病菌体外接种均有显著的预防效果，平均防治效率可达75%以上(表4)，DG1发酵液对大白菜菌核病体外预防效果见图7。

3 讨论

类芽孢杆菌属(PaenibacillusAsh,Priest & Collin,1994)最早归类于芽孢杆菌属，后从中分离出来。除具有芽孢杆菌属的特征外，类芽孢杆菌属还具有以下

表4 DG1发酵液的体外接种预防效果Table 4 Prevention effect of detached leaf inoculation by DG1 fermentation broth

注：A：番茄枯萎病菌；B：番茄黑斑病菌； C：花椰菜黑斑病菌；D：大白菜菌核病菌。Note: A:F.oxysporum of tomato. B: A.alternate of tomato. C: A.alternate of cauliflower. D: S.sclerotiorum of cabbage.图5 菌株DG1对4种蔬菜病原真菌的抑制作用Fig.5 Inhibition of four vegetable pathogenic fungus by strain DG1

注：A：对照; B为处理。Note:A: Control. B: Treatment.图6 菌株DG1产生的挥性物质对大白菜菌 核病菌菌丝生长的影响Fig.6 Effect of volatile substances produced by strain DG1 on mycelial growth of S. sclerotiorum

注：A： 正面；B： 背面；叶片左边均为对照;叶片右边均为处理。Note: A: Front. B: Back. Left side of two leaves for control. Right side of two leaves for treatment.图7 体外接种预防效果Fig.7 Prevention effect of detached leaf inoculation

特征：细胞呈杆状，革兰氏染色阳性、阴性或可变，以周生鞭毛运动。类芽孢杆菌属细菌可在多种环境中存在，且与人类、动物、植物和环境的关系密切[12-13]。其中大多数类芽孢杆菌属细菌存在于土壤中，通常在根际。这些根际细菌能促进植物生长，作为根际促生菌用于农业生产中[14-17]。许多类芽孢杆菌属细菌可产生性质比较稳定的多肽类抗菌物质[18]，具有良好的拮抗植物病原真菌活性，可用于多种植物病害的生物防治[19-23]。因此，类芽孢杆菌属细菌是一类极具开发前景和应用价值的生防细菌[24-25]。

申顺善等[26]从化香根际土壤中分离得到的多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)HK18-8，果实体外接种试验表明，其对辣椒炭疽病的防治效果可达88%以上。吉沐祥等[27]筛选一株多黏类芽孢杆菌JX-13，其对草莓枯萎病的防治效果达96%。Xu等[28]研究发现多粘类芽孢杆菌SC09-21可有效防治辣椒疫病并促进辣椒生长。Zhang等[29]筛选的多粘类芽孢杆菌ShX301，在温室防治棉花黄萎病试验中可降低棉花黄萎病的发病率和严重程度，并对棉花生长有显著促进作用。本研究分离的拮抗菌DG1，经鉴定为克里布所类芽孢杆菌(P.kribbensis)，为类芽孢杆菌属的一种。研究发现DG1是一种广谱性的拮抗菌，其对多种植物病原菌(大白菜菌核病菌、花椰菜黑斑病菌、番茄黑斑病菌等)具有拮抗作用，具有作为生防菌开发的前景和应用价值。今后工作应从拮抗菌DG1在蔬菜根际的定殖能力，以及拮抗菌DG1对蔬菜生长的影响两方面开展。

在培养DG1的过程中发现，DG1可产生气体，查阅相关文献有多种芽孢杆菌属细菌产生的挥发性物质具有抑菌活性。宗英等[9]研究发现一株贝莱斯芽孢杆菌JS25R可产生36种挥发性物质，并可抑制禾谷镰刀菌菌丝的生长。李宝庆等[30]研究发现枯草芽孢杆菌BAB-1至少可产生17种物质，并能够抑制番茄灰霉菌的生长。本试验对拮抗菌DG1产生的挥发性气体的抑菌性进行了初步研究，发现DG1产生的挥发性气体具有抑菌活性，可显著抑制大白菜菌核病菌的生长，但其产生挥发性气体的成份还需进一步试验确定。

4 结论

本研究筛选出一株对大白菜菌核病菌具有拮抗作用的菌株DG1，经形态观察、生理生化鉴定及16S rDNA测序鉴定为克里布所类芽孢杆菌。进一步研究发现，DG1是一种广谱性的拮抗菌，对多种植物病原真菌有抑制作用，其发酵液与挥发性物质对植物病原菌的生长均有抑制作用，可以作为绿色生产中防治植物病害的一种生防菌。