麸金樱子中没食子酸的提取工艺优化

余中霞，李振兴，何亚芬，方文超，黄道明

1.上饶市检验检测认证院，江西 上饶 334000；2.江西中医药大学附属医院，江西 南昌 330006

金樱子为蔷薇科植物金樱子Rosa laevigata Michx的干燥成熟果实，别名糖罐、山鸡头子、金罂子。10～11 月果实成熟变红时采收；干燥，除去毛刺。具有固精缩尿、固崩止带、涩肠止泻的作用［1］。分布于江西、福建、安徽、江苏、贵州、台湾、湖南等地，在江西分布广泛，主要在九江、樟树、新余、南昌、上饶等地。金樱子的药用价值高，近年国内对金樱子成分和药理活性成分的研究成果不断涌现，果肉中有效成分包括黄酮、多糖、酚酸、三萜类等，三萜类具有抗阿尔茨海默病作用［2］，总多酚有降脂作用［3］，多糖具抗氧化活性［4］，有研究表明金樱子、牛磺酸、枳椇子联合用药对小鼠酒精性肝损伤有保护作用［5］。没食子酸为金樱子总酚酸的主要成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒等多种生物活性，可为神经系统疾病、心血管系统疾病、肝纤维化、糖尿病和肿瘤等的辅助治疗［6-8］。但对于麸制金樱子质量标准的研究较少。本实验采用正交试验优选麸金樱子的提取工艺，为麸金樱子的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695 型高效液相色谱仪（配DAD 检测器，沃特斯科技上海有限公司）；DZKW-S-C 电热恒温水浴锅；Sartorius MSE125P-1CE-DU 型 电 子天 平；普力菲尔FST-IV-10 型超纯水机。

1.2 试药

麸金樱子饮片，用金樱子药材（由江西瑞康堂中药饮片有限公司提供，经上饶市检验检测认证院副主任药师黄道明鉴定为正品）麸炒；没食子酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110831-201906,纯度：91.5 %）；乙腈和甲醇均为HPLC 级（国药集团化学试剂有限公司），乙醇、磷酸为分析纯，超纯水。

2 方法与结果

2.1 炮制工艺

取金樱子肉100 g,加麦麸10 g，160 ℃炒制3 min［9］，取出，筛去麦麸。

2.2 供试品溶液中没食子酸含量的测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Cyan-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1%磷酸溶液-乙腈（97∶3）；检测波长：272 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：28 ℃。

2.2.2 溶液的制备 （1）没食子酸对照品溶液的配制：精密称取没食子酸对照品10.87 mg，置50 mL 量瓶中，加70%甲醇超声使没食子酸溶解，定容，摇匀，没食子酸对照品溶液的浓度为0.198 9 mg/mL(按纯度折算)，过滤，即得。（2）供试品溶液的配制：取按“2.1”方法麸制的金樱子饮片，粉碎，过4 号筛，精密称取0.5 g，置圆底烧瓶中，加70%甲醇50 mL，称重，置75 ℃水浴30 min，取出，放冷，补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 正交试验设计 参照文献［10-13］，以水浴温度（A）、甲醇浓度（B）和提取时间（C）为三因素，进行L9（34）正交试验，以没食子酸含量为评价性指标，优选出对没食子酸提取显著的因素，正交设计因素水平见表1，正交试验设计及没食子酸含量测定结果见表2，正交试验方差分析表3。由表2和表3 可见，水浴温度（A）和甲醇浓度（B）对提取结果有显著影响，即A＞B＞C（水浴温度＞甲醇浓度＞提取时间），最佳工艺为A2B2C1，即以70%的甲醇为提取溶剂，75 ℃水浴回流30 min。

表1 因素水平表

表2 正交试验设计与没食子酸含量结果

表3 方差分析结果

2.2.4 验证试验 取麸金樱子饮片，粉碎，过4 号筛，按最佳工艺进行提取，平行操作3 次，结果没食子酸的含量分别为265.43、263.89、264.11 μg/g，平均为264.48 μg/g，RSD 为0.31%，表明该提取工艺稳定可靠。

2.2.5 方法学考察 （1）系统适用性试验：取“2.2.2”项下的溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，进样量为10 μL，记录色谱图。结果，供试品溶液色谱图在与对照品溶液色谱图相应的位置上有相同的色谱峰。没食子酸峰与相邻色谱峰的分离度大于1.5，理论塔板数按没食子酸计不低于3 000。见图1。

图1 HPLC色谱图：A.对照品溶液，B.供试品溶液

（2）线性关系考察：精密量取“2.2.2 ”项下没食子酸对照品溶液0.25 mL，0.50 mL，1.0 mL，2.0 mL，3.0 mL 分别置10 mL 容量瓶中，用70%甲醇稀释，定容，摇匀，过滤，测定。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制备标准曲 线。得回归方程Y=3×10-5X-0.007 5，r=0.999 3，没食子酸在0.497 5 μg/mL～5.970 0 μg/mL 范围内有良好线性关系。

（3）精密度试验：取“2.2.2 ”项下没食子酸对照品溶液，按“2.2.1”项下方法测定峰面积，连续进样测定6 次，记录主峰面积，计算RSD 为0.25%（n=6），结果表明仪器精密度良好。

（4）重复性试验：称取同一批供试品按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6 份，测得没食子酸的峰面积的RSD 为1.42%。结果显示方法重复性良好。

（5）稳定性试验：取“2.2.2”项下的供试品溶液，室温放置24 h,每隔2 h 测定一次，没食子酸RSD为0.45%。表明供试品溶液24 h 内稳定。

（6）加样回收率试验：取已知含量的供试品，精密称定6 份，分别精密加入“2.2.2 ”项下没食子酸对照品溶液0.4 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下方法测定峰面积，计算，得回收率为93.78%，RSD=1.08%。见表4。

3 讨论

经高效液相色谱仪的DAD 检测器扫描200～400 nm 范围内的光谱图，结果没食子酸在214 nm和272 nm 波长处有最大吸收；流动相分别比较了不同比例的乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-水；柱温比较了室温、28 ℃、35 ℃；当波长为272 nm，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（97∶3）,柱温 28 ℃时主峰与其他杂质峰分离度较好，可用于麸金樱子中没食子酸含量测定。

本研究采用正交试验法，研究了多因素、多水平的常用试验设计方法［14］。本次试验数据显示影响因素为水浴温度＞甲醇浓度＞提取时间，且水浴温度和甲醇的浓度对没食子酸的提取影响显著。本次实验比较了水浴回流和超声提取，超声提取不能很好地控制温度，故采用水浴回流。比较了乙醇和甲醇作为溶剂，甲醇提取液的目标物质浓度更大，杂质更少，故采用不同浓度的甲醇提取，结果表明70%甲醇提取效果最好。经工艺验证，本次研究所制定的提取工艺稳定性较好，可操作性强。

目前，《中国药典》只有金樱子多糖的含量测定，对其他主要成分未做相关规定，且鲜有文献报道麸制金樱子的质量标准研究。本次试验主要通过优化麸制后金樱子中没食子酸的提取工艺，为麸金樱子的总酚酸测定提供参考。