马铃薯bHLH转录因子家族全基因组鉴定与表达分析

冯建英 李立芹 鲁黎明

（四川农业大学农学院，成都 611130）

转录因子（transcription factors，TFs）是植物中一类极其重要的调节因子，在应激调控网络和信号传导通路中起着关键性的作用［1-2］。它们可参与DNA结合和蛋白质二聚化活动，从而在植物不同发育阶段对不同组织中的基因表达进行调控［3］。bHLH转录因子是植物体内存在的第二大类调节蛋白，因具有特定的bHLH结构域而得名［4］。bHLH转录因子既可作为转录激活子又可作为转录抑制子，参与植物生长发育、形态建成及应答环境胁迫等过程，如调节类黄酮与花青素的合成等［5］。研究植物bHLH基因的基本性质、结构及功能，对理解其在植物生长发育及响应胁迫中的作用有重大帮助。

目前，已鉴定的植物bHLH家族成员数量较多，如在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中有162个［6］，小 麦（Triticum aestivumL.）中有225个［7］，白 菜（Brassica rapassp.pekinensis）中有230个［8］，苹果（Malus pumilaMill.）中有188个［9］，桑树（Morus notabilis）中有173个［10］，苦荞（Fagopyrum tataricum）中有164个［11］，茄子（Solanum melongenaL.）中有121个［12］，银杏（Ginkgo biloba）91个［13］，玉米（Zea maysL.）161个［14］。研究表明，拟南芥转录因子bHLH104和bHLH115在其铁稳态中发挥重要作用，bHLH104和bHLH115突变使拟南芥在铁缺乏时耐受性明显降低，而其过表达会强烈促进铁的积累［15-16］。在缺铁条件下存在的NtbHLH1作为转录激活子定位于烟草细胞核，其过表达会导致根系变长，铁螯合物还原酶的活性增强［17］。OsbHLH107可通过影响穗壳纵向细胞数量，进而调节水稻籽粒大 小［18］。FtbHLH2、FtbHLH55及FtbHLH155等 基因在苦荞花中高表达，而FtbHLH67、FtbHLH70及FtbHLH157等基因却在果实中高表达，证实了苦荞bHLH基因的组织表达特异性［11］。121个茄子bHLH转录因子成员中，SmbHLH1与SmbHLH117参与到茄子花青素的生物合成过程中［12］。SlbHLH95表达上调会促进番茄果实的成熟，并且对乙烯的敏感度会升高［19］。与此同时，植物的bHLH成员还参与了胁迫响应。如，西瓜的ClabHLH32、ClabHLH41、ClabHLH71、ClabHLH58以及拟南芥bHLH68、水稻bHLH035均参与了脱落酸（ABA）胁迫应答［20-22］；甜橙的bHLH18能够调控抗氧化酶基因的表达，从而增强其抗寒能力［23］。

马铃薯（Solanum tuberosum）属于茄科茄属的一年生草本植物，适应力强且产量大，是世界四大粮食作物之一，具有较高的营养价值与药用价值。目前，国内外关于马铃薯bHLH转录因子方面的报道较少，刘玉汇［24］发现StbHLH1是调控花色素苷重要的协同调控因子，Tai等［25］研究发现bHLH家族在马铃薯中可能具有一定程度抗霜冻的能力。

本研究通过对马铃薯bHLH转录因子进行全基因组鉴定，分析其序列特征、理化性质、组织表达与胁迫响应表达情况，并构建其蛋白互作网络，以期为其功能研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为马铃薯组培苗，品种为川芋10号，由四川农业大学马铃薯研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 马铃薯bHLH家族的鉴定 从Pfam获得bHLIH保守结构域PF00010，并以此为参考序列，利用HMMER3.0软件对马铃薯基因组数据库（http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/index.shtml）进行检索获得候选序列。为保证候选序列的可靠性，运用SMART在线软件和NCBI-CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）对其进行完整保守域检测，去除冗余及不完整序列，保留仅有一个HLH结构域的氨基酸序列。

1.2.2 bHLH蛋白理化性质分析 利用在线软件ExPASy中 的ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/），对马铃薯bHLH家族候选蛋白的氨基酸数、分子量等理化性质进行分析［26］。

1.2.3 功能保守域和保守基序分析 利用WebLogo网站，对马铃薯bHLH氨基酸序列进行保守域分析。同时利用MEME在线程序（http://meme-suite.org/tools/meme）对马铃薯bHLH基因序列进行保守基序分析。

1.2.4 同源性分析 从PlantTFDB网站下载拟南芥bHLH家族蛋白在TAIR上的序列号，并获取其氨基酸序列。使用软件MEGA-X的NJ法和iTOL（https://itol.embl.de/itol.cgi）构建系统进化树，bootstrap值设为1 000［27］。

1.2.5 马铃薯bHLH家族成员在染色体上的位置从马铃薯基因组数据库中查找每个StbHLH基因的染色体位置信息，利用在线软件MG2C（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）进行染色体定位作图。

1.2.6 表达模式分析及qRT-PCR验证

1.2.6.1 生物信息学分析 从马铃薯基因组数据库获得StbHLHs基因在根、叶、块茎组织及盐、热、甘露醇与脱落酸胁迫下的FPKM值［28-29］，利用软件TBtools绘制出其表达模式图。

1.2.6.2 组织表达模式分析 分别采集马铃薯组培苗的根、茎、叶，液氮速冻后，进行总RNA的提取，并 采 用qRT-PCR方 法，对StbHLH2、StbHLH14、StbHLH15、StbHLH34、StbHLH39、StbHLH53、StbHLH57、StbHLH59、StbHLH66、StbHLH80、StbHLH90、StbHLH108等12个基因在马铃薯根、茎、叶中的表达量进行分析。引物如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

总RNA的提取方法以及qPCR的反应程序如下：采用Trizol法提取总RNA，再将其反转录为cDNA，利用荧光定量PCR技术进行基因相对表达量的测定。PCR扩增程序为94℃ 2 min；94℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。选用马铃薯EF1αL为内参基因（EF1αL-F：5′-CTTGTACACCACGCTAAGGAG-3′；EF1αL-R：5′-GTCAATGCAAACCATTCCTTG-3′）。

1.2.6.3 响应非生物胁迫的表达模式分析 对生长30 d的马铃薯组培苗进行低钾（10 μmol/L）、ABA（1 μmol/L）、干旱（5% PEG-6000）、高盐（200 mmol/L Nacl）以及H2O2（10 mmol/L）处理，在处理后0、3、6和12 h取样。采用qRT-PCR的方法，分析上述12个基因响应非生物胁迫的表达模式。总RNA的提取方法以及qPCR的反应程序见1.2.6.2。

1.2.6.4 总RNA的提取及qPCR反应程序 总RNA的提取方法以及qPCR的反应程序见1.2.6.2。所有样品设置为3次生物学重复，用2-ΔΔCt方法计算相对表达量，运用Excel 2010进行统计学分析。

2 结果

2.1 马铃薯bHLH家族成员的鉴定

利用软件HMMER 3.0对马铃薯蛋白数据库进行检索，并通过NCBI和SMART等网站对保守结构域进一步验证，剔除冗余，最后筛选出108个具有典型bHLH结构域的马铃薯bHLH家族成员。根据各家族成员所在染色体的位置，将其编号为StBHLH1-StbHLH108。

通过分析马铃薯bHLH家族蛋白的基本理化性质（表2）。马铃薯bHLH转录因子蛋白序列所含的氨基酸数目为62（StbHLH62）-694（StbHLH84）。分子量为7 527.78（StbHLH62）-75 939.94 Da（StbHLH84）。理论等电点为4.55（StbHLH46）-10.40（StbHLH62）。

表2 基本理化性质分析Table 2 Analysis of basic physical and chemical properties

续表Continued

2.2 bHLH转录因子的保守基序分析

利用WebLogo在线程序，对马铃薯bHLH家族保守域进行分析（图1）。并通过在线工具MEME对马铃薯bHLH转录因子家族成员进行Motif的预测，得到5个不同Motif保守元件（图2）。其中，Motif1和Motif2为马铃薯bHLH家族成员所共有，并且位置相邻。而Motif5却仅在StbHLH1、StbHLH11、StbHLH12、StbHLH14这4个成员中存在。以上结果表明，HLH结构域不是由一个或几个特定的保守元件构成的。

图1 bHLH保守结构域的logoFig. 1 Logo of bHLH conservative domain

图2 马铃薯bHLH转录因子的保守基序分析Fig. 2 Conserved motif analysis of bHLH transcription factor in S. tuberosum

2.3 马铃薯bHLH家族蛋白的同源性分析

根据鉴定出的马铃薯bHLH家族蛋白序列与随机选取的拟南芥bHLH家族的30条氨基酸序列间的相似度，使用软件MEGA-X构建系统进化发育树。结果（图3）表明，138个bHLH转录因子被划分为16个亚家族，其中，第10亚族的bHLH成员最少，为2个，第16亚族最多，为27个。同一亚族成员具有相似保守基序。表明同一亚家族成员可能具有相类似的功能，在马铃薯生长发育中发挥类似的作用。

图3 马铃薯bHLH家族蛋白系统发育进化树Fig. 3 Phylogenetic tree of bHLH family proteins in S. tuberosum

2.4 马铃薯bHLH基因在染色体上的位置

根据马铃薯基因组数据库提供的StbHLHs的染色体位置信息，绘制其染色体定位模式图（图4）。结果表明，108个StbHLHs在马铃薯12条染色体上呈现不均匀分布。第1染色体分布的StbHLHs数量最多，为15个；第11染色体分布的StbHLHs数量最少，为3个。其中第9和第10染色体上分布的StbHLH家族成员均为7个。以上结果表明，StbHLHs在马铃薯染色体上分布密度是不等的。第1和第2染色体上共有3对基因紧密连锁，分 别 为StbHLH11/StbHLH13、StbHLH12/StbHLH14、StbHLH24/StbHLH26，属于旁系同源基因。

图4 马铃薯bHLH家族基因的染色体定位Fig. 4 Chromosome localization of bHLH family genes in S. tuberosum

2.5 马铃薯bHLH转录因子的表达模式分析

利用数据库信息，分析108个StbHLHs在根、叶、块茎中的表达模式，以及响应盐（150 mmol/L NaCl）、甘露醇、生长素、脱落酸及赤霉素、热（35℃）等非生物胁迫的表达行为，并利用软件TBtools绘制了聚类表达模式图（图5）。

从图5可以看出，StbHLHs在不同组织中的表达具有特异性。StbHLH2、StbHLH5、StbHLH18和StbHLH99等在3个组织中均具有较高的表达丰度，尤其是前两者在叶片和块茎中的表达值均为最高，表明它们可能主要参与马铃薯叶片及块茎发育过程。然而，也有基因在这3个组织中均不表达，如StbHLH1、StbHLH4、StbHLH10等。StbHLH12和StbHLH13仅在马铃薯叶片中有较低的表达量，而StbHLH17和StbHLH76却只在叶片中不表达。StbHLHs的组织表达特异性进一步揭示了马铃薯StbHLHs行使功能时的空间特征。

图5 马铃薯bHLH转录因子的表达模式分析Fig. 5 Expression pattern analysis of bHLH transcription factor in S. tuberosum

马铃薯StbHLHs还响应了非生物胁迫的诱导。在盐（150 mmol/L NaCl）、甘露醇、生长素、赤霉素及脱落酸、热（35℃）等胁迫处理下，这108个StbHLHs的表达模式明显不同。其中，StbHLH84、StbHLH87及StbHLH89等基因，在所有胁迫处理下表达均上调；StbHLH47、StbHLH56及StbHLH80等 基 因 表 达 均 下 调；StbHLH12、StbHLH14及StbHLH55等基因表达无变化。在盐和甘露醇胁迫下，StbHLH83表达程度明显提高，StbHLH20表达量下降，而StbHLH11、StbHLH74和StbHLH82等基因均无明显响应。内源激素诱导条件下，StbHLH46和StbHLH65相较其他成员有较高的表达丰度；StbHLH103唯独在ABA胁迫下表达量明显增加，暗示其可能正调控ABA信号传导途径，从而提高马铃薯抗旱性。热处理时，StbHLH15、StbHLH50及StbHLH73等基因表达均显著下调；StbHLH20、StbHLH48及StbHLH60等基因表达均显著上调，表明这些基因在马铃薯热激反应中具有正向调节的作用。

2.6 马铃薯部分bHLH转录因子的组织表达模式分析

采用qRT-PCR方法分析StbHLH14等12个基因在马铃薯根、茎、叶中的表达情况（图6）。可得StbHLH14、StbHLH34、StbHLH66及StbHLH90均在茎中相对较高的表达量；StbHLH39在叶中的表达量是最高的；而StbHLH59在根中有较高表达量。StbHLH2和StbHLH15在马铃薯根、茎及叶中的表达量均无明显差异。

图6 马铃薯bHLH转录因子组织表达模式分析Fig. 6 Tissue expression pattern analysis of bHLH transcription factor in S. tuberosum

2.7 马铃薯部分bHLH转录因子在非生物胁迫下的表达模式分析

为了对生物信息学分析结果进行验证，分析了StbHLH2等12个基因在低钾、脱落酸（ABA）、干旱、高盐及H2O2处理不同时间的表达量（图7）。StbHLH15和StbHLH53在低钾及ABA处理下，表达量有明显的上调；StbHLH15和StbHLH59在模拟干旱胁迫环境下，表达丰度显著增加，说明其可能参与调控ABA信号通路；StbHLH90在高盐处理3 h后表达量达到了最高；StbHLH108在5个胁迫处理下的表达均明显增加，暗示其可能在马铃薯响应逆境中起着至关重要的作用。StbHLH2在低钾和高盐处理下，表达量均有显著的上调；StbHLH15在高盐处理后发生了下调；StbHLH39在低钾、高盐、H2O2处理后均有显著下调。

图7 马铃薯bHLH转录因子胁迫处理表达模式分析Fig. 7 Expression pattern of bHLH transcription factor in S. tuberosum under stress

3 讨论

bHLH转录因子广泛存在于植物体内，它主要调控植物生长发育，如花的形态建成、表皮毛的发育及种子萌发等，同时在植物养分吸收、生物合成及信号转导过程中具有重要作用［30-31］。本研究鉴定出108个马铃薯bHLH家族成员，保守元件分析后，共获得5个Motifs。其中，Motif1和Motif2相邻，并存在于所有bHLH家族成员中，推测两者共同组成了bHLH保守结构域，该结果与陈红霖等［6］对绿豆全基因组的研究结果相似。聚类分析表明，138个bHLH被分为16个亚家族，而同一亚族的成员大多具有相似的保守元件。进化及染色体定位表明，108个马铃薯bHLH家族成员不均匀地分布在12条染色体上。在1号和2号染色体上共存在3对旁系同源基因，并且紧密连锁，该结果与王寻等［32］研究结果相吻合。

植物的bHLH基因往往具有组织表达特异性。黄芩bHLH3在根中表达值最高，而叶片中基本不表达，bHLH6的表达情况与其恰恰相反［33］。NtbHLH93在烟草盛花期子房组织，及不同生育期侧根中的表达量很高［34］。与上述研究结果相似，马铃薯转录组数据分析结果显示，StbHLH18和StbHLH99等在根、叶及块茎组织中均具有较高的表达丰度，StbHLH13仅在叶片中有低表达。此结果表明，马铃薯bHLH家族成员在其特定发育阶段及特定组织中有独特的表达特点。

植物的bHLH转录因子，也参与了生长发育及胁迫响应过程。番茄bHLH22过表达会促进乙烯生成及激活SlSFT或SlLFY，从而促进果实成熟［35］。在ABA胁迫诱导下，西瓜的ClabHLH32和ClabHLH71随着时间的推移表达量呈先降低后升高的趋势，而ClabHLH41和ClabHLH58先上调后下降［20］。拟南芥bHLH68参与了ABA信号传导及代谢过程，并在干旱胁迫响应时有重要功能［21］。盐胁迫下，水稻bHLH035突变体出现种子萌发延迟的现象，且盐诱导的ABA分解基因在种子萌发过程中表达下调，导致了ABA过度积累［22］。甜橙bHLH18可直接或间接地调控抗氧化酶基因的表达，从而能够增强其抗寒能力［23］。

本研究热图分析中，在盐（150 mmol/L NaCl）、甘露醇、生长素、脱落酸及赤霉素、热（35℃）等非生物胁迫下，马铃薯StbHLHs呈现出不同的表达模式，暗示了其参与植物发育进程及环境胁迫的普遍性。其中，StbHLH84、StbHLH87和StbHLH89均上调表达，则说明了其可能以正向调控的方式，参与马铃薯生长以及响应多种逆境胁迫的调节。StbHLH103在ABA的诱导下，表达量显著上升，说明该基因可能参与了ABA的信号转导途径，并可能在马铃薯的ABA依赖的非生物胁迫（如干旱）响应中发挥重要作用。

qRT-PCR分析结果表明，StbHLH14、StbHLH34在茎中表达量较高，而StbHLH59和StbHLH39分别在根和叶中有高表达，说明了马铃薯bHLH转录因子具有不同的组织表达特异性。StbHLH15和StbHLH53在不同的胁迫处理后会有明显的上调，然而有少数基因在胁迫处理后表达会减少，如StbHLH39等，说明这些基因分别作为不同信号转导途中的正调控及负调控因子。StbHLH108在低钾、脱落酸、高盐、干旱及H202这5个胁迫处理下均发生了上调。综上，马铃薯bHLH家族成员在响应逆境胁迫时均发挥着一定的作用。

4 结论

在马铃薯全基因组中，共鉴定出同属于bHLH基因家族的108个StbHLHs。它们不均匀地分布在马铃薯12条染色体上，均具有典型的HLH结构域，且同一亚族成员的保守基序相似。马铃薯bHLH基因具有组织表达特异性，并且响应盐、热、旱、ABA等非生物胁迫。