AMG9810对帕金森病大鼠学习记忆能力的影响及其机制

谢阳 刘梦兰 罗思维 孟仁亮 李作孝 (西南医科大学附属第一医院神经内科，四川 泸州 646000)

帕金森病(PD)主要临床表现包括有肌强直、静止性震颤、运动性迟缓及姿态障碍〔1〕。 动物研究表明多巴胺能神经元的缺失可导致PD模型动物的认知功能受损〔2〕。目前普遍认为多巴胺神经元的死亡与环境毒素、遗传因素、氧化应激、免疫系统异常和神经兴奋毒性增强等诸多因素〔3,4〕均有关联。其中氧化应激因素与 PD 黑质致密区多巴胺神经元病理性缺失及PD发病的关系尤为密切，其被认为与PD的诸多病理生理过程及行为学表现有关〔5〕。

辣椒素受体(TRPV)是一 种广泛分布于包括黑质区在内的大脑各脑区的非特异性阳离子通道〔6〕。 体内外的实验研究〔7，8〕均证明 TRPV1 受体的激活可诱导中脑多巴胺神经元的死亡。因此，阻断 TRPV1 受体的激活可能对该脑区的神经元起到保护作用。本研究观察TRPV1受体阻断剂 AMG9810 处理对PD大鼠学习记忆能力的影响。

1 材料与方法

1.1动物 成年雄性Sprague-Dawley 大鼠，6～8周龄，体重200～250 g，均购于成都达硕实验动物有限公司，编号：SPFC5717-199，饲养条件如下：分为4只一笼，在室温为22℃，湿度为50%～60%的安静环境下饲养，12 h人工昼夜(8∶00～20∶00光照)，通风均良好，大鼠可自由地摄水摄食，实验的动物使用程序均按照西南医科大学实验动物管委员会的相关操作条例。

1.2主要试剂 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氮吡啶(MPTP，武汉阿斯本生物技术有限公司，货号AS1075)，AMG9810(ASPEN，货号AS1004)，活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase3)一抗(ASPEN，货号AS1086)，超氧化物歧化酶(SOD)和脂质过氧化物丙二醛(MDA)试剂盒(国药集团化学试剂有限公司，货号10023418)。

1.3MPTP 诱导PD大鼠模型的建立 腹腔注射 4%水合氯醛将大鼠麻醉后，将其固定于脑立体定位仪上，头部去毛并用碘伏消毒手术周围区域。查阅大鼠解剖图谱和参考前期文献，模型组大鼠按照立体坐标前卤前后(AP):-5.0 mm;中缝左右(ML):±2.0 mm;颅骨硬脑膜平面向下(DV):-7.7 mm〕往大脑双侧进行 MPTP(1 μmol 溶于 2 μl生理盐水) 注射，对照组大鼠则在相同位置注入等量的生理盐水，手术14 d后进行水迷宫行为学测试。为了观察 TRPV1 受体阻滞剂对大鼠学习记忆能力的影响，另将 30 只大鼠随机分为对照组、模型组和给药组， 并按照上述立体坐标分别往大鼠颅内注入生理盐水或者MPTP，其中给药组在在手术后第一天开始通过立体注射的方式连续给予 AMG9810(10 nmol/0.5 μl)颅内离体定位注射14 d，然后将各组大鼠行水迷宫实验观察学习记忆能力的变化。

1.4Morris 水迷宫实验 各组大鼠连续训练4 d，在训练期间分别从4个不同的起始部位放入迷宫中，将登陆平台作为最终的目标，第4天采用水迷宫数据采集和分析软件记录相关数据及图像结果：有效区停留的时间、穿越平台的次数、到达平台的潜伏期。

1.5SOD和MDA的检测 大鼠处死后分别取脑组织，并按照检测说明书测定SOD活力及MDA含量。

1.6活化 Caspase3 蛋白表达水平的检测 水迷宫测试完毕之后立即将大鼠处死，根据大鼠图谱在大鼠的黑质区取材。将组织研碎并重悬于配好的细胞裂解缓冲液中，经12 000 r/min 离心后，将蛋白质提取出来，采用二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白定量以后将其煮沸而变性，取出等量样品以12%的十二烷基钠钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行电泳。在进行电泳后在聚偏氟乙烯(PVDF)膜上印上蛋白，然后把 PVDF 膜在5% 脱脂牛奶之中浸泡，在室温中封闭 2 h，接着将活化的 Caspase3 抗体(1∶5 000)在4℃的温度中孵育过夜，再使用辣根过氧化物酶标记的特异性二抗(1∶5 000)在室温当中进行摇床孵育 2 h， TBST 液漂洗3遍(以8 min/遍的速度)后，加入化学发光的底物，并将其显影在凝胶成像系统中，最后使用美国国立卫生研究院开发的 Image J 软件对条带灰度加以分析。通过去计算各组目的蛋白条带的灰度值与内参蛋白 β-actin 灰度值之间的比值，对目的蛋白进行半定量，同时去比较各组间目的蛋白的表达水平的差异。

1.7统计学处理 采用GraphPad Prism软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1各组学习记忆能力比较 模型组经MPTP损伤后，其到达平台的潜伏期较对照组显著延长(P<0.05)；在有效区停留的时间和穿越平台的次数与对照组相比显著下降(P<0.01)。见表1。给药组经TRPV1受体阻断剂AMG9810处理后，其到达平台的潜伏期较模型组显著降低(P<0.05)； 而与模型组相比，给药组有效区停留的时间和穿越平台的次数则显著升高。见表2。

2.2AMG9810 处理对SOD活性和MDA含量的影响 与对照组相比，模型组SOD活性显著降低，而MDA含量则显著升高(均P<0.01)。给药组SOD活性较模型组显著升高，MDA含量则较模型组明显降低(均P<0.01)。见表3。

表1 MPTP损伤对大鼠学习记忆能力的影响

表2 AMG9810处理对大鼠学习记忆能力的影响

表3 各组处理组大鼠SOD活性和MDA水平

2.3AMG9810 处理对 Caspase-3蛋白表达水平的影响 模型组活化 Caspase3蛋白表达水平(3.07±0.25)较对照组(1.12±0.12)显著上升，给药组活化Caspase3蛋白表达水平(1.78±0.34)较模型组显著降低(均P<0.01)。见图1。

图1 各组Caspase-3 蛋白表达水平

3 讨 论

PD同样有非常特征性的病理改变，即中脑黑质中的多巴胺能神经元出现变性及死亡，从而导致纹状体多巴胺的含量显著性减少而引起该病的发生。除了在SN多巴胺神经元的损失,PD中另一个病理变化是突触核蛋白及TRPV1过度表达激活后而诱发氧化应激反应、细胞凋亡及线粒体损伤，尤其是主要病理形式，α-突触核蛋白的磷酸化和不可溶〔9～11〕，PD动物模型中MPTP应用显著增加TRPV1的氧化应激和线粒体结构异常〔12,13〕。

重要的是,慢性使用AMG9810处理显著地抑制MPTP导致的TRPV1过表达激活,可能会减少氧化应激和线粒体功能障碍,从而造成运动功能的改善。MPTP处理小鼠中AMG9810成功地扭转了MDA和抗氧化酶SOD的下降，而TRPV1 是一种同源四聚体的、非选择性阳离子通道,研究表明该受体的激活能够起到降血压和降胆固醇及促进肌肉增长、抑制肌肉萎缩等功效。研究〔14～16〕证实TRPV1的激活可诱导中脑多巴胺神经元的死亡，而相反，阻断该受体的激活可以对多巴胺神经元起到保护作用。本实验结果发现 TRPV1 受体阻滞剂 AMG9810 的连续处理可显著改善 MPTP 对大鼠学习记忆能力的损伤。与此同时，AMG9810 还能通过增强 SOD 活性， 降低 MDA 含量和抑制 Caspase-3 蛋白激活等方式抑制 MPTP 诱导的 氧化应激反应。本研究发现，MPTP 可以使大鼠学习记忆能力显著下降，而 TRPV1 阻滞剂 AMG9810 则可以明显改善这种学习记忆能力的损伤，该作用可能与 AMG9810 可以通过降低 MPTP 诱导的氧化应激反应有关。这为将来 AMG9810 用于PD治疗提供了理论基础。