凝结芽孢杆菌BC-HYI对蛋雏鸡促生长作用的研究

2022-03-10刘博文卢天航崔德凤张永红

动物营养学报 2022年2期

胡婷刘博文* 张华吴琼周波卢天航崔德凤** 张永红**

(1.北京农学院动物科学技术学院，兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京102206；2.河北农业大学动物科技学院，保定071000；3.中牧实业股份有限公司，北京100070)

肠道是机体营养物质消化吸收和免疫调节的重要器官[1]，是维持机体内环境正常的重要屏障[2]，肠道屏障功能的完整直接关系到动物的健康状况，而肠道黏膜通透性指标的检测则能直接反映出肠道屏障功能的状况。蛋雏鸡在幼龄期肠道菌群系统和免疫系统尚未完全建立，很容易受到营养和环境应激等因素影响，导致肠道屏障损伤，大量的细菌和毒素穿过胃肠黏膜进入血液，致使肠道局部或整个机体细胞因子失衡，免疫机能下降，造成肠道菌群紊乱，消化吸收功能下降，激活Toll样受体4(TLR4)炎症通路，引发各种肠道炎症性疾病，因此育雏期是肠道发育和微生物定植的关键时期[3]。益生菌在保卫肠道健康中扮演重要角色[4]。蒋磊等[5]在1日龄肉鸡饲粮中添加30 mg/kg的凝结芽孢杆菌制剂，发现49日龄时的终体重、平均日增重(ADG)均呈上升趋势。邢冠润[6]的试验表明，饲粮中添加凝结芽孢杆菌可提高产蛋鸡肠道健康，显著降低血清D-乳酸(D-Lac)含量及二胺氧化酶(DAO)活性，提高小肠黏膜分泌型免疫球蛋白A(SIgA)含量。凝结芽孢杆菌能改善动物机体肠道菌群结构，修复受损的肠道屏障，提高机体免疫力和抗病力，增强机体对营养物质代谢和利用的能力，促进生长。从各种文献中可以得出凝结芽孢杆菌的作用在肉鸡和产蛋鸡中的研究较多，而对1～30日龄的蛋雏鸡的研究较少。因此，本试验使用实验室提取并验证后制成的凝结芽孢杆菌BC-HYI菌粉，检测其对1～30日龄蛋雏鸡生长性能、肠道黏膜通透性及TLR4信号通路相关基因表达和蛋白表达，旨在探究凝结芽孢杆菌BC-HYI对蛋雏鸡的促生长作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

凝结芽孢杆菌BC-HYI(北京农学院中兽医实验室)，IX-711型显微镜(日本OLYMPUS)，SN-354型酶标仪(北京普朗新技术有限公司)，Step one-Plus型实时荧光定量PCR仪(美国赛默飞公司)，Lodigit型WB凝胶成像仪(上海天能科技有限公司)，DAO酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)，D-Lac ELISA检测试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)，SIgA ELISA检测试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)，白细胞介素-10(IL-10)ELISA检测试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)等。

1.2 试验设计

选取1日龄、初始体重(约0.55 kg)相近的京红蛋雏鸡288只，随机分为4组，每组6个重复，每个重复12只，重复之间体重接近。空白组(CON组)饲喂基础饲粮(基础饲粮组成及营养水平见表1)，连续灌服生理盐水；益生菌低、中、高剂量组饲喂基础饲粮，同时分别连续灌胃浓度为106、107、108CFU/mL的凝结芽孢杆菌BC-HYI，各1 mL,分别记为LOW、MID、HIGH组，饲养周期为28 d。蛋雏鸡自由采食，充分饮水，按正常免疫程序进行免疫接种。

1.3 检测指标

1.3.1 生长性能

于饲喂第1、2、3、4周，对空白组和益生菌组的蛋雏鸡进行称重。称重前1 d晚上禁食，自由饮水。每日称量给料重量，次日加料前，对剩余饲粮进行称重。分别计算蛋雏鸡的平均日采食量(ADFI)、ADG和料重比(F/G)。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)

1.3.2 肠道组织结构

取第2、4周蛋雏鸡进行剖检，每组18只，采集蛋雏鸡的十二指肠、空肠和回肠肠道组织，每段约5 cm，采集后用4%多聚甲醛进行固定24 h，制备组织切片、苏木精-伊红(HE)染色，测量不同肠道的绒毛长度与隐窝深度，计算肠道绒隐比。

绒毛长度：取绒毛顶部到底部的距离，每个样本切片取6个值，最后算其平均值。

隐窝深度：肠腺最底部与2个绒毛开口之间的距离，每个样本切片取6个值，最后算其平均值。

绒隐比=绒毛长度/隐窝深度。

1.3.3 血清中DAO活性及D-Lac和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量

取第1、4周蛋雏鸡，每组18只，心脏采血3～4 mL，室温放置至少0.5 h，3 000 r/min离心10 min，吸取上层血清(注意不要吸到下面的沉淀)转移到1.5 mL灭菌的EP管中， ELISA试剂盒测定血清中DAO活性及D-Lac和TNF-α含量。

1.3.4 空肠黏膜黏液蛋白2(MUC2)和紧密连接蛋白mRNA相对表达量及SIgA和IL-10含量

取第1、4周蛋雏鸡，每组18只，空肠纵向剖开，用0.9%生理盐水缓慢冲去食糜，避免将肠绒毛冲掉，用消毒后的无齿镊沿同一方向轻轻刮取黏膜，装入EP管中，用ELISA试剂盒测定空肠黏膜中SIgA和IL-10含量，用实时荧光定量PCR的方法测定黏膜中MUC2、闭合蛋白(Occludin)和闭锁小带蛋白-1(ZO-1)mRNA相对表达量，具体引物信息见表2。扩增体系25 μL：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 5.5 μL。采取二步法扩增：预变性95 ℃ 10 min；扩增95 ℃ 15 s；退火温度为56 ℃，20 s，共40个循环；熔解曲线，55～95 ℃，温度以0.3 ℃/s速度提升。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参基因，采用2-△△Ct法计算mRNA相对表达量。

表2 引物信息

1.3.5 空肠黏膜TLR4信号通路相关基因mRNA相对表达量与蛋白表达量

空肠黏膜样品采集同1.3.4，分别用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹(Western blot)的方法测定蛋雏鸡空肠黏膜TLR4信号通路中TLR4、核转录因子-κB(NF-κB)mRNA相对表达量和蛋白表达量，具体引物信息见表2，荧光定量步骤同1.3.4。

1.4 数据统计分析

试验数据均用GraphPad Prism 7.00软件进行统计处理，结果用平均值±标准差(mean±SD)表示，用t检验分析差异显著性，P>0.05为无显著差异，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 凝结芽孢杆菌BC-HYI的鉴定

菌粉复壮培养后经纯度检验符合凝结芽孢杆菌BC-HYI的特征，菌落表面凸起，呈白色透明的圆形，革兰氏染色呈蓝紫色、革兰氏阳性，菌体呈杆状、纯度单一，见图1。

2.2 凝结芽孢杆菌BC-HYI对蛋雏生长性能的影响

在试验过程中，蛋雏鸡的死淘率很低，仅在中剂量组共计死亡2只。由表3、表4、表5可知，饲喂不同剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI，ADFI随着饲养时间的延长呈上升趋势，但与CON组无显著差异(P>0.05)。前3周时，饲喂凝结芽孢杆菌BC-HYI的蛋雏鸡ADG有增长，但无统计学差异(P>0.05)，未显著降低F/G(P>0.05)；第4周时，与CON组相比，凝结芽孢杆菌BC-HYI极显著提高了蛋雏鸡ADG(P<0.01)，极显著降低F/G(P<0.01)，以1×108CFU/mL浓度效果最明显。

图A：菌落形态；图B：革兰氏染色。Figure A: colony morphology; figure B: Gram staining.

2.3 凝结芽孢杆菌BC-HYI对蛋雏鸡肠道结构的影响

由表6可知，与CON组相比，第2周时，低剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI显著提高十二指肠绒隐比(P<0.05)，中、高剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI极显著提高十二指肠绒隐比(P<0.01)，显著提高回肠绒隐比(P<0.05)；3个剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI均显著提高空肠绒隐比(P<0.05)；第4周时，中剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI显著提高十二指肠、回肠绒隐比(P<0.05)；中、高剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI显著提高空肠绒隐比(P<0.05)。

2.4 凝结芽孢杆菌BC-HYI对蛋雏鸡血清中DAO活性及D-Lac、TNF-α含量的影响

由表7可知，与CON组相比，第4周时，中、高剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI显著降低蛋雏鸡血清中DAO的活性(P<0.05)；第1周时，低、高剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI显著降低蛋雏鸡血清中D-Lac的含量(P<0.05)；第4周时，凝结芽孢杆菌BC-HYI显著降低蛋雏鸡血清中D-Lac的含量(P<0.05)；第1周和第4周时，高剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI极显著降低蛋雏鸡血清中TNF-α含量(P<0.01)，随着雏鸡饲养时间的增加，血清中TNF-α含量有增加的趋势。

表3 蛋雏鸡平均日采食量

表4 蛋雏鸡平均日增重

表5 蛋雏鸡料重比

表6 蛋雏鸡肠道绒隐比

表7 蛋雏鸡血清中DAO活性及D-Lac、TNF-α含量

2.5 凝结芽孢杆菌BC-HYI对蛋雏鸡空肠黏膜黏液蛋白和紧密连接蛋白mRNA相对表达量的影响

由图2、图3、图4可知，与CON组相比，第1周时，低剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI可以显著上调空肠黏膜中MUC2的mRNA相对表达量(P<0.05)，中、高剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI可以极显著提高其mRNA相对表达量(P<0.01)；第4周时，3个剂量均可以极显著提高空肠黏膜中MUC2的mRNA相对表达量(P<0.01)。与CON组相比，在第1周、第4周时，中、高剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI均能极显著提高蛋雏鸡空肠黏膜中Occludin的mRNA相对表达量(P<0.01)。与CON组相比，第1周时，低剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI可以显著提高空肠黏膜中ZO-1的mRNA相对表达量(P<0.05)，高剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI可以极显著提高空肠黏膜中ZO-1的mRNA相对表达量(P<0.01)；第4周时，低剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI可以显著提高空肠黏膜中ZO-1的mRNA相对表达量(P<0.05)，中、高剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI可以极显著上调空肠黏膜中ZO-1的mRNA相对表达量(P<0.01)。

与空白组相比，“*”为P<0.05；“**”为P<0.01；无标注为差异不显著(P>0.05)。下图同。

图3 蛋雏鸡空肠黏膜中Occludin的mRNA相对表达量

图4 蛋雏鸡空肠黏膜中ZO-1的mRNA相对表达量

2.6 凝结芽孢杆菌BC-HYI对空肠黏膜免疫的影响

由表8可知，与CON组相比，第1周时，低、中剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI可以显著提高空肠黏膜中SIgA的含量(P<0.05)，3种剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI对空肠黏膜中IL-10含量的上调作用不显著(P>0.05)；第4周时，中剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI可以显著提高空肠黏膜中SIgA的含量(P<0.05)，中、高剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI能极显著提高空肠黏膜中IL-10的含量(P<0.01)。

2.7 凝结芽孢杆菌BC-HYI对TLR4信号通路的影响

由图5、图6可知，与CON组相比，凝结芽孢杆菌BC-HYI能降低空肠黏膜中TLR4的mRNA相对表达量以及蛋白表达量，但效果不显著(P>0.05)；中、高剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI能极显著降低蛋雏鸡空肠黏膜中NF-κB的mRNA相对表达量以及蛋白表达量(P<0.01)。

3 讨论

3.1 凝结芽孢杆菌BC-HYI对蛋雏鸡生长性能的影响

生长性能代表动物机体对食物的消化、吸收能力，既是食物对动物体生理功能的体现，也是动物生长、发育情况的直观表现[7]，因此生长性能在动物健康中至关重要。畜禽的ADFI、ADG和F/G是能够反映益生菌在实际应用中真正作用的有效指标[8]。研究发现，益生菌在畜禽的生长方面起着重要作用，因此其作为添加剂越来越常见。王乙茹等[9]研究表明，饲粮中添加1.0×107CFU/t的凝结芽孢杆菌后，1日龄的健康AA肉鸡比正常饲喂饲粮组ADG显著增加；Khajeh等[10]发现，饲喂肉鸡100 mg/kg的凝结芽孢杆菌能显著提高肉鸡的ADG，降低F/G，最终体重也达高水平，从而使肉鸡的生长性能得到有效的改善；李树鹏[11]饲喂1日龄海兰蛋雏鸡芽孢杆菌(活菌数≥1×1010CFU/g)会显著提高其全期增重以及显著降低F/G。从本试验结果也可以证明凝结芽孢杆菌的促生长作用：低、中、高剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI均能提高蛋雏鸡ADF，降低F/G，这种促进作用在试验后期表现地更为显著。凝结芽孢杆菌在肠道中定植时会间接提高消化酶的活性[12]，加快对饲粮成分的降解，增加肠道蠕动，提高动物对营养物质的吸收，促进动物的生长发育。

表8 蛋雏鸡空肠黏膜中SIgA和IL-10含量

图5 蛋雏鸡空肠黏膜中TLR4、NF-κB的mRNA相对表达量

3.2 凝结芽孢杆菌BC-HYI对蛋雏鸡肠道结构的影响

有研究表明，凝结芽孢杆菌可促进肠绒毛发育，增强肠绒毛蠕动能力，缓解应激和感染造成的肠道损伤，增强肠道消化吸收和屏障功能[13]。肠道绒隐比能反映出肠道蠕动的强弱，比值越大，肠道蠕动越快，反之蠕动效果不佳[8]。孙焕林等[13]研究发现，凝结芽孢杆菌可通过增加黄羽肉鸡的肠道绒隐比来提高肠道吸收作用。王政等[14]发现，饲粮添加凝结芽孢杆菌可以缓解氧化应激导致的白羽肉鸡空肠损伤，增加绒毛长度和绒隐比。宫秀燕[15]研究表明，饲粮中添加凝结芽孢杆菌可提高肉鸡空肠绒隐比，增加杯状细胞数量，抵抗沙门氏菌的感染。谢丽曲等[16]研究表明，饲粮添加凝结芽孢杆菌能显著提高肉鸭十二指肠绒毛高度以及绒隐比。由于试验第1周肠道绒毛生长较不完整，因此生长到第2周时取样检测，本研究结果与上述研究结论一致，饲喂凝结芽孢杆菌BC-HYI显著提高各肠段的绒隐比，增强肠道蠕动。

3.3 凝结芽孢杆菌BC-HYI对蛋雏鸡空肠中黏液蛋白和紧密连接蛋白mRNA相对表达量的影响

益生菌能够促进肠上皮细胞分泌大量黏液，从而增加黏液层厚度以及黏液蛋白的含量，通过与肠道致病菌占位竞争更好地黏附在肠上皮细胞，从而增强肠屏障的保护功能[17]。紧密连接对肠道通透性的大小也起着至关重要的作用，其与肠上皮细胞之间平衡是保障肠道上皮结构完整的前提[18]，益生菌通过增强自身与肠道表面特异性受体结合的竞争力，降低病原菌的结合位点来保护和增加紧密连接。吴昌征等[19]在蛋鸡饲粮中添加不同剂量的益生菌均可显著提高空肠黏膜紧密连接蛋白Occludin和ZO-1 mRNA相对表达量，且具有剂量依赖性。本研究发现不同浓度凝结芽孢杆菌BC-HYI对空肠黏膜中的MUC2、Occludin和ZO-1的mRNA相对表达量均有不同程度的提高，尤其在第4周的时候效果更显著，因此，凝结芽孢杆菌BC-HYI能够增强蛋雏鸡的肠道屏障作用，减少有害物质侵袭。

3.4 凝结芽孢杆菌BC-HYI对蛋雏鸡血清中DAO活性和D-Lac含量的影响

D-Lac和DAO是检测胃肠黏膜损伤的主要指标。D-Lac是哺乳动物肠道多种细菌发酵产生的代谢产物，肠道健康时无法被利用；DAO则是哺乳动物肠黏膜上层绒毛中的细胞内酶，其活性很高，正常情况下存在于肠道中，其他组织中不易见[20]。雷凯[21]的试验证明地衣芽孢杆菌能显著降低血清中D-Lac含量和DAO活性，从而降低肠道通透性，改善肠道健康。本试验发现凝结芽孢杆菌BC-HYI能显著降低蛋雏鸡血清中DAO活性和D-Lac的含量，从而降低肠道通透性，减少肠黏膜损伤。

图6 蛋雏鸡空肠黏膜中TLR4、NF-κB的蛋白表达量

3.5 凝结芽孢杆菌BC-HYI对空肠黏膜免疫的影响

细胞因子在炎症和免疫反应中发挥重要作用，其中TNF-α是主要的促炎细胞，IL-10则是重要的抑炎因子。大量的TNF-α损坏肠上皮细胞，增加通透性，促使黏膜层的中性粒细胞大量分泌，在趋化因子的作用下向炎症部位聚集，进而加重肠道炎症反应，导致肠黏膜受损严重[22]。IL-10的主要作用是抑制炎症细胞的活化，减少细胞因子的产生，避免炎症的发生，其还可以抑制白细胞聚集产生炎症因子和细胞黏附因子，从而避免更多的炎症因子向炎症部位聚集，降低炎症产生几率[23]。当肠道发生炎症时，会激活肠道免疫系统。SIgA是存在于肠道黏膜固有层浆细胞产生的主要免疫效应因子，是肠上皮细胞抵御病原菌入侵的重要防线[24]。当肠道组织受到抗原刺激后，激活肠道免疫应答，产生大量SIgA与抗原结合，从而降低病原体在肠道中黏附和定植的能力，保护肠道黏膜免受病原菌的损害[25]。王婷婷等[26]对大肠杆菌感染的小鼠饲喂嗜酸乳杆菌和瑞士乳杆菌，从而探究小鼠肠道黏膜免疫的变化情况，结果显示，补充益生菌可显著促进肠道组织分泌大量SIgA，提高黏膜免疫功能，从而加强肠道屏障功能。在本试验中，凝结芽孢杆菌BC-HYI能极显著降低血清中TNF-α的含量，提高空肠黏膜SIgA和IL-10的含量，从而提高蛋雏鸡的免疫作用以达到凝结芽孢杆菌BC-HYI增强蛋雏鸡的肠道健康作用。

3.6 凝结芽孢杆菌BC-HYI对TLR4信号通路的影响

Toll样受体(TLRs)/NF-κB信号通路调节炎症和疼痛相关基因的转录[27]。TLRs广泛分布在肠道的各种上皮细胞和免疫细胞表面，其中Toll样受体2(TLR2)和TLR4与肠道菌群密切相关[28]。在生理条件下，TLRs对正常菌群无反应，表现为“安静”状态，这可能是自然选择和长期进化共同作用的结果，最终导致TLRs对某些菌群不出现任何应答或有较低水平的应答[29]。益生菌能抑制TLRs/NF-κB信号通路，但正常情况下效果不是特别显著。在TLR4信号通路发挥作用时，其蛋白的磷酸化反应更能代表此通路被激活，因此选择用磷酸化的NF-κB的变化更能反映出TLR4/NF-κB信号通路的作用机制。蒲俊宁[30]的试验发现，凝结芽孢杆菌对正常情况下断奶仔猪空肠黏膜中TLR4信号通路的抑制作用不显著，而NF-κB的降低可能与烯脂酰还原酶1(MOD1)信号通路有关。本试验中饲喂蛋雏鸡不同剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI能降低其空肠黏膜中TLR4 mRNA相对表达量以及蛋白表达量，但效果不显著；而中、高剂量凝结芽孢杆菌BC-HYI能显著降低蛋雏鸡空肠黏膜中NF-κB的mRNA相对表达里及磷酸化NF-κB蛋白表达量，可能的原因是正常情况下凝结芽孢杆菌BC-HYI降低NF-κB的表达不是经过TLR4/NF-κB信号通路的，此结果需另探究。