柑橘类植物精油的抗菌活性及其作用机制

2022-03-10聂德超李艳玲

动物营养学报 2022年2期

张卓聂德超赵琛李艳玲

(北京农学院动物科学技术学院，北京102206)

在畜牧业生产体系中，抗生素的滥用不仅会引发超级细菌的产生，其残留亦会造成畜产品安全和环境污染问题[1]。此外，一些抗生素对肠道微生物具有广谱抗菌活性，不仅能杀死有害菌，同时也能杀死有益菌，因此，长期使用抗生素会降低动物微生物群体的多样性，增加病原体在肠道内定植的机会[2]。我国农业农村部规定，自2020年7月1日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料[3]。在这样的背景下，寻找能够替代抗生素的绿色饲料添加剂显得尤为迫切。植物精油由于其具有显著的抗菌活性，被认为是有潜力的抗生素替代品[4]。柑橘类植物精油(citrus essential oils，CEOs)是生产量最大、商业化程度最高的植物精油之一，因其成本相对较低，更益于广泛应用于生产[4]。据报道，CEOs具有选择性抗菌活性，对有益菌[如乳酸杆菌(Lactobacillus)]的生长动力学影响较小，而对有害菌[如大肠杆菌(Escherichiacoli)]的生长动力学影响较大[5]，利用这一特性应用于动物生产中将具有非常重要的价值。本文着重介绍了CEOs的抗菌活性及其作用机制，为其在畜牧生产中的应用提供理论依据。

1 CEOs简介

CEOs是一种从柑橘类植物中提取的芳香类混合物，具有天然绿色、无毒无害、无残留和无刺激等特点[6]，主要包括甜橙精油、葡萄柚精油、柠檬油、佛手柑精油、橘子精油和苦橙叶精油等[7]。CEOs来源于植物的不同部分，如叶、花、果实和果皮等[8]。提取、加工CEOs的常用方法有蒸馏法、溶剂法、压榨法、超临界二氧化氮萃取法和分子蒸馏法等，其中蒸馏法是最常用、最洁净的方法，95%的植物精油均可以用蒸馏法萃取获得[9]。CEOs具有广泛的生物活性，包括抗菌、抗氧化和抗炎等[7]；且由于其可以阻碍畜禽舍中霉菌的生长，抑制或杀灭大肠杆菌、沙门氏菌(Salmonella)等有害菌群，提高环境清洁度和畜禽舒适度[6]，在畜禽上具有良好的应用前景。随着替抗研究的深入和人们对绿色、无公害、无残留的天然抗菌剂的要求，对CEOs抗菌生物活性的研究越来越多，尤其是其选择性抗菌活性的研究引起了本课题组的关注，拟开展更多深入的研究。

2 CEOs的化学组成

CEOs是复杂的碳氢化合物，也是萜类和非萜类的含氧衍生物的混合物，由功能基团组成，包括醛、醇、酮和其他复杂分子，如酯和有机酸[10]。CEOs的组成因品种、季节和地理位置以及果实成熟期而异[11]，包含多种化合物，如柠檬烯(limonene)、α-蒎烯(α-pinene)、β-蒎烯(β-pinene)、γ-松油烯(γ-terpinene)、桧烯(sabinene)、β-月桂烯(β-myrcene)和芳樟醇(linalool)等(图1)[7]。通常，每种CEOs都含有20～60种化合物[12]，其中，挥发性化合物占85%～99%，主要包括单萜类(monoterpene)、倍半萜烯类(sesquiterpenes)和倍半萜类(sesquiterpenoids)[13]。而单萜烯是最主要的挥发性化合物，主要由2个异戊二烯(C5H8)组成[11]。D-柠檬烯属于单萜烯，是CEOs的主要活性成分，具体含量因CEOs的种类而异。例如，佛手柑精油中D-柠檬烯含量为32%～45%，柠檬油中D-柠檬烯含量为45%～76%，甜橙油中D-柠檬烯含量为68%～98%[14-15]。通过了解CEOs的化学组成，有利于进一步研究CEOs发挥生物活性的有效活性成分。

图1 CEOs的一些重要化合物

3 CEOs的抗菌活性

植物精油以其显著的广谱抑菌活性以及残留毒性小的优势，近年来在抑菌性能上得到了广泛关注[16]。CEOs及其大部分化合物均具有抗菌活性，例如，D-柠檬烯具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗癌的作用[17-18]，α-蒎烯和β-蒎烯具有抗菌、抗炎和抗氧化的作用[19]，且近年来关于CEOs抗菌活性的研究也越来越多。因此，本文重点介绍了几种主要的CEOs的抗菌活性。

3.1 几种主要CEOs的抗菌活性

3.1.1 甜橙精油

甜橙精油是少数有镇静作用的精油之一，有着甜橙香味。甜橙精油可抑制多种细菌的生长，包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、鼠伤寒沙门氏菌等(Salmonellatyphimurium)[20-22]；以及几种真菌，如黄曲霉(Aspergillusflavus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、土曲霉(Aspergillusterreus)等[23-25]。

3.1.2 柠檬油

柠檬油为淡黄色液体，具有柑橘类的香气，清爽而新鲜。柠檬油对蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)等具有有效的抗菌活性[26]，对黑曲霉(Aspergillusniger)、疣状青霉(Penicilliumverrucosum)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)等具有抗真菌作用[25]。

3.1.3 葡萄柚精油

葡萄柚性凉，具有清热、止渴之效。葡萄柚精油气味清新、香甜，有柑橘的果香味。葡萄柚精油是以新鲜果皮为原料的，采用冷榨方法，出油率在0.5%～1.0%。葡萄柚精油对蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等均有较强的抗菌活性；对黑曲霉、白色念珠菌(Candidaalbicans)等具有较强的抗真菌活性[27-28]。

3.1.4 佛手柑精油

佛手柑精油萃取自佛手柑的果皮，精油呈翠绿色，味道较清新，类似甜橙和柠檬。佛手柑精油抑制多种细菌的生长，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和沙门氏菌等[29]，对汉逊酵母(Hanseniasporaguilliermondii)、脆壁克鲁维酵母和白色念珠菌等具有抗真菌活性[29-30]。

3.1.5 橘子精油

橘子精油除了具有独特的柑橘皮味之外，还带有少许幽幽花香。橘子精油以其广谱抗菌和抗真菌作用而闻名。它能抑制几种细菌的生长，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和金黄色葡萄球菌[31-32]；抑制几种真菌的生长，包括意大利青霉(Penicilliumitalicum)、黄曲霉和链格孢菌(Alternariaalternata)等[32-33]。

3.2 不同CEOs的抗菌能力比较

不同的CEOs由于其化学成分及结构的差异性，使得它们具有不同的抗菌效果，其抗菌能力与其不同的活性成分及活性成分间的互作有关[1]。金如月[33]研究表明，CEOs中不同的化学成分具有不同的抗菌能力。众多活性成分中，酚类的抗菌性最强，其次是醛类、醇类、酮类、酯类和烃类[34]。此外，大量研究表明，羟基(—OH)、甲氧基(—OCH3)、烯烃键以及亲脂性化学结构对精油抗菌能力有着重要作用，可提高其抗菌能力[35-36]。在抗菌评价体系中，最低抑菌浓度(MIC)是衡量抗菌效果的常用指标之一，MIC值越小，说明其抗菌效果越好[1]。表1列出了几种常见CEOs的MIC值，比较其抗菌能力[25,33,37-38]。从表中可以发现，不同的CEOs对同一种细菌具有不同的抗菌力，同一种CEOs对不同的细菌也具有不同的抗菌力。总体而言，表1中所列5种常见的CEOs，佛手柑精油和柠檬油的抗菌效果较佳。

表1 不同CEOs的MIC值

3.3 CEOs的选择性抗菌活性

CEOs具有选择性抗菌活性。研究报道，CEOs可以抑制病原菌活性，如李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌[20,30]，同时刺激有益微生物发挥作用，如猪的乳酸杆菌[39]。CEOs对大肠杆菌具有较高的抑菌活性，而对乳酸杆菌的抑菌活性很小甚至没有影响，且CEOs的抑制作用存在剂量依赖性[2]。此外，还有研究发现，当CEOs作用于细菌时，乳酸杆菌的MIC值是大肠杆菌的2倍多，最低杀菌浓度(MBC)值是大肠杆菌的4倍多[2]。以上研究均表明，CEOs对有害菌和有益菌具有选择性抗菌活性。

CEOs的选择性抗菌活性可能与细菌细胞膜的结构有关。目前CEOs对大肠杆菌和乳酸杆菌的选择性抗菌活性已有一定的研究报道。通常认为，植物精油对革兰氏阳性病原菌的抑制效果高于革兰氏阴性病原菌[40]，这2种细菌对植物精油敏感性的差异被认为是细胞壁结构存在差异造成的，因为革兰氏阳性菌缺乏革兰氏阴性菌所具有的外膜，这种外膜含有极性末端和跨膜通道的脂多糖(LPS)，它允许亲水性溶质通过，使疏水性化合物如植物精油组分难以扩散到细胞中。因此，这将使革兰氏阴性菌对植物精油更具有耐药性[41]。然而，在Ambrosio等[2]的研究中却得到了相反的结果，大肠杆菌为革兰氏阴性菌，乳酸杆菌为革兰氏阳性菌，但是，大肠杆菌比乳酸杆菌对CEOs更敏感，因为，植物精油抗菌谱取决于职务精油化合物官能团对单个或多个靶点的特异性。一些精油的化合物能够分解大肠杆菌的外膜，释放与这层膜相关的物质并穿透细胞，从而引发破坏效应，达到抑菌效果[42]。CEOs中的化合物可能也具有这种能力，从而使得CEOs对大肠杆菌更敏感。此外，Viuda-Martos等[43]研究揭示了CEOs只有在高浓度下才能抑制乳酸杆菌，这也在一定程度上证明了CEOs对大肠杆菌和乳酸杆菌的选择性抑菌活性。然而，对于CEOs选择性抗菌活性机制有待更深入的研究。

4 CEOs的抗菌作用机制

CEOs具有高度疏水性，能够促进其与细菌脂质双分子层互作，从而影响细胞膜的结构完整性和功能，并且精油能够在脂质双分子层中大量积累，最终导致细胞破裂，使细胞凋亡，其作用机制包括以下几个方面。

4.1 对细菌细胞形态的影响

CEOs可以通过对细菌细胞形态的影响，使其结构发生改变，使细胞内物质从细胞中流出，导致细菌细胞凋亡，最终达到抑菌效果。Tang等[44]通过扫描电镜观察不同浓度精油处理对细菌细胞形态的影响，研究发现，空白对照组细菌细胞呈规则形状，内部结构完整，表面光滑，无损伤；经CEOs处理后，与CEOs接触的细菌细胞表面呈现不规则状、皱缩和粗糙，表明CEOs可导致细菌细胞的损伤，从而影响细菌细胞膜的通透性和完整性。

4.2 对细菌细胞膜的影响

植物精油可以抑制并破坏细菌细胞膜，其与细菌细胞膜作用，使膜结构发生巨大变化，引起膜的膨胀和不稳定，增加膜的流动性和渗透性，从而达到抗菌效果[34]。膜的破坏会导致细胞内物质的流失，致使细菌死亡。CEOs一般主要通过3种方式对细菌细胞膜造成破坏，从而对致病菌活性产生抑制作用。

1)影响细胞膜渗透性。细菌细胞膜的渗透性用相对电导率(relative electric conductivity)表示，膜渗透性的破坏，会导致胞内电解质泄漏，相对电导率增加。Ambrosio等[4]研究表明，用CEOs处理大肠杆菌U21后其相对电导率升高，表明细菌细胞膜渗透性被破坏。此外，用佛手柑精油处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，其相对电导率均有所增加，且金黄色葡萄球菌相对电导率高于大肠杆菌，这说明佛手柑精油会使细菌细胞膜渗透性破坏，且对金黄色葡萄球菌作用效果更明显[37]。

2)影响细胞膜完整性。蛋白质和核酸是细胞内极其重要的大分子，涉及细胞结构和遗传信息[45]，核酸和蛋白质在260 nm处的吸光度是膜完整性的一个指标[37]。Bajpai等[46]研究发现，用佛手柑精油处理过的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的吸光度值显著增加，表明佛手柑精油影响了膜的完整性，从而导致细菌细胞死亡。

3)影响细胞膜电位。细菌细胞膜电位用荧光强度表示。膜电位的变化会影响细菌的代谢活性，因此，可以通过细菌细胞膜电位的变化判断细菌是否凋亡。Song等[47]研究表明，CEOs处理金黄色葡萄球菌，会使金黄色葡萄球菌的荧光强度显著下降，导致细胞代谢活动异常，扫描电子显微镜图像也显示出柑橘精油处理金黄色葡萄球菌细胞结构受到破坏。由此可见，CEOs可通过直接接触细菌细胞，使细胞膜发生变化，破坏细胞膜的结构，从而实现抑菌作用。

4.3 对细菌细胞内物质泄漏的影响

当细菌细胞接触到植物精油时，会使细胞膜的渗透性发生变化，使得细胞内的大分子物质，比如蛋白质、核酸和ATP等泄漏，从而加剧细菌死亡。因此，直接测定细菌细胞内外大分子物质的含量，也是检测植物精油是否具有抗菌活性的方法之一。

1)对细菌内蛋白质、核酸的影响。用CEOs处理金黄色葡萄球菌后，金黄色葡萄球菌细胞的胞外蛋白质和核酸含量显著增加，而细胞内蛋白质和核酸含量明显下降，这表明CEOs作用于细菌，会使其胞内蛋白质和核酸泄漏，致使细菌失活[47]。

2)对细菌ATP的影响。ATP对细菌细胞功能至关重要，包括能量转换要求、营养物质加工和运输、结构大分子的合成和各种酶的分泌[46]，通过ATP浓度的测定可以判断是否具有抑菌效果。用CEOs处理金黄色葡萄球菌后，金黄色葡萄球菌细胞的胞内ATP浓度显著下降[47]，这说明胞内的ATP泄漏，表明CEOs具有抑菌作用。