利用大肠埃希菌生产N-糖基化重组蛋白研究进展

胡学军， 李 威， 吴 琼， 丁 宁

(大连大学 大连市糖重组与重组蛋白修饰重点实验室，辽宁 大连 116600)

糖基化修饰在药物蛋白功能、稳定性及血浆半衰期等方面起到重要作用。真核生物中糖基化修饰蛋白在维持蛋白稳定、细胞信号转导、免疫调控、细胞间的互作、细菌-宿主识别互作等过程中发挥着重要功能[1]。N-糖基化修饰是蛋白糖修饰的主要方式之一，寡糖通过与新生肽链中特定天冬酰胺的酰胺氮连接。在原核生物中也广泛存在寡糖合成途径与N-糖基化修饰蛋白质机制，形成病原菌外膜上的脂寡糖。脂寡糖在病原菌黏附和宿主细胞侵入、逃避宿主免疫防御中发挥重要作用[2]。2002年，瑞士联邦理工学院Wacker等研究人员首次将空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)N-糖基化基因簇(pgl) 转入大肠埃希菌，成功地在大肠埃希菌工程菌株中N-糖基化修饰外源蛋白质，开创了利用大肠埃希菌N-糖基化修饰重组蛋白新纪元[1]。近20年间，人们利用不同来源的糖基化转移酶、寡糖转移酶，在大肠埃希菌中开展类人源和人源化N-糖基化重组蛋白、病原菌寡糖的糖疫苗制备研究。本文详细阐述了大肠埃希菌生产N-糖基化重组蛋白的机制、应用及前景。

1 利用大肠埃希菌生产N-糖基化重组蛋白的机制

天然原核生物N-糖基化修饰系统主要由4个必要元件组成: 糖基化识别序列、糖基转移酶(glycosyl transferase，GT)、糖苷酶、糖底物供体，它们分别负责接受、添加、修剪和提供底物以合成寡糖，并进一步通过依赖寡糖转移酶(oligosaccharyl transferase，OST)/非依赖OST的途径将寡糖转移到靶蛋白上[2]。将以上机制转移到大肠埃希菌中，实现N-糖基化重组蛋白，可重塑合成寡糖链及重组蛋白修饰，将在糖疫苗生产、糖基化修饰药物蛋白等方面具有巨大应用潜力[3]。目前应用较多的是空肠弯曲杆菌来源的N-糖基化寡糖转移酶(Glycosylated oligosaccharide transferase，pglB)即CjpglB和猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)来源的N-糖基化转移酶(N-glycosyltransferase，NGT)即ApNGT两种糖基化修饰重组蛋白系统，分别在大肠埃希菌的质周腔和胞质内建立了N-糖基化修饰的重组蛋白途径，其原理如图1所示。

1.1 依赖寡糖转移酶OST的N-糖基化修饰系统

一般细菌和古细菌中都存在 OST 依赖的N-糖基化修饰蛋白途径，目前研究最清楚的原核糖基化系统来自空肠弯曲杆菌，其中完成N-糖基化功能的 OST 称为CjPglB，与细菌毒力和宿主-病原体的相互作用有关[4]。通常细菌寡糖通过糖基转移酶在细胞质中组装，然后翻转到质周腔中，最终由 OST 转移到受体蛋白上(图1)。

细菌和真核生物的 OST 依赖性糖基化系统存在显著的区别，这对于糖工程改造生产类人源化糖蛋白非常重要[5]。①细菌脂联寡糖(lipid-linked oligosaccharide，LLO)通常组装在十一烷基焦磷酸脂上，且与该 LLO 连接的聚糖一般不会被修剪。②单亚基细菌 OST如CjPglB 的简单性使它们更容易进行纯化和改造，从而促进折叠蛋白的翻译后修饰。③与真核 OST 相比，细菌 OST 对受体序列和 LLO 有严格的特异性，如一些细菌 OST除要求其受体序列类似于真核生物 N-X-S/T序列，还需要相对于糖基化天冬酰胺的 X-2(D/E-X-1-N-X+1-S/T, X+1 ≠P)位置的负电荷残基(D/E)。目前已经鉴定了优化的氨基酸序列 D-Q-N-A-T可作为CjPglB的糖基化识别序列 (glycosylation tag，GlycTag)进行较高效地糖基化修饰。④就 LLO 特异性而言，细菌N-连接的 OST 比其真核生物具有更广泛的聚糖结构松弛性[2]。

图1 利用大肠埃希菌生产N-糖基化重组蛋白主要机制示意图Fig.1 Schematic diagram of the main mechanism of N-glycosylated recombinant protein production via Escherichia coliA:依赖OST的N-糖基化系统；B:不依赖OST的N-糖基化系统A:OST-dependent N-glycosylation system; B:OST-independent N-glycosylation system

1.2 非依赖寡糖转移酶OST的N-糖基化修饰系统

近年来，人们发现了在细菌胞质中发挥功能的N-和O-连接糖基化系统。这些系统通常糖基化修饰细胞外黏附蛋白等，促进病原菌与人类细胞的黏附。2013年，瑞士联邦理工学院Aebi课题组首先将来源于胸膜肺炎放线杆菌的N-糖基化转移酶(ApNGT)转入大肠埃希菌中实现N-糖基化修饰重组蛋白[6]；体外实验发现使用 UDP-Glc 或 UDP-Gal 作为可溶性糖供体将单糖转移到细胞质中的天冬酰胺残基上启动N-糖基化修饰重组蛋白[7]。随后陆续发现了其他几种NGTs。尽管 ApNGTs 与 OST 缺乏同源性，但它们具有相同的糖基化识别序列 N-X-S/T，引起了人们极大的兴趣[8]。Aebi课题组Naegeli等研究开发了 NGT可识别的其他GlycTag 序列，应用这些 GlycTags (如 GGNWTT)成功地在体内和体外对不同重组蛋白进行了N-糖基化修饰[7]。目前天然存在和工程化改造的 NGTs 已被证明能利用 UDP-GlcN、UDP-Glc、UDP-Gal、UDP-Xyl、GDP-Glc 和 GDP-Man等底物进行糖基化修饰重组蛋白[9]。然而，天然的NGTs 不能利用 UDP-GlcNAc 或 UDP-GalNAc 糖供体，使其直接应用于生产N-连接和O-连接的人源化糖链仍存在困难[10]。

迄今为止，ApNGT已经被充分表征并且用于糖工程，在靶蛋白上形成可进一步修饰的GlcNAc位点。这种特有的顺序性修饰特点可以允许基于 NGT 的系统规避 OST 系统中存在的还原端糖结构限制的问题[11]。研究发现，由 NGT 安装的单个葡萄糖残基可以胞内组装成糖聚合物 (可用于疫苗的制备)[12]，多聚唾液酸[11]，N-乙酰乳糖胺和其他岩藻糖基化和唾液酸化形式的乳糖[13-14]。

与依赖 OST的N-糖基化系统相比较，OST 非依赖性途径在其拓扑结构，糖组分和可能的氨基酸连接(包括天冬酰胺、精氨酸、丝氨酸、羟基赖氨酸，羟脯氨酸等)方面更加多样化[15]，主要具有三个特点，使它们能够形成优势互补。①大多数不依赖于 OST 的系统不需要脂质相关的 GTs 或糖供体，使它们更容易在其原生宿主之外合成和操作[16]；②不依赖于OST的系统通常不需要跨膜运输目标蛋白或糖供体，从而使大肠埃希菌细胞质中的糖蛋白合成成为可能[11]；③不依赖于 OST 的系统可按顺序依次转移来自糖供体的单糖，不受 LLOs 的 OST 特异性的限制，允许更灵活的模块化组装和设计。

2 应用大肠埃希菌生产N-糖基化重组蛋白

利用大肠埃希菌生产糖基化基因工程抗体等重组蛋白及糖疫苗是目前热点研究方向。自2012年Aebi课题组首次在大肠埃希菌实现类人源化糖链Man3GlcNAc2核心五糖N-糖基化修饰重组蛋白后，利用多种原核生物进行糖基化修饰的技术一直在不断探索中[17]，其技术核心是将其他原核生物来源的寡糖转移酶(识别并将寡糖转移到重组蛋白上的糖基化识别序列上)和多种糖基转移酶(非模板驱动合成寡糖)在大肠埃希菌中共表达，完成寡糖合成及N-糖基化定点修饰蛋白基本过程[18-19]。近几年研究结果表明该系统可以实现定点(识别特异氨基酸序列)、均质性(糖链微观均质、糖蛋白宏观均质)修饰重组蛋白，这是真核系统无法比拟的优势。真核细胞合成的聚糖性质较其他合成途径而言与人的更为相似(图2)。但是，天然真核细胞表达系统糖表位修饰N-糖基化重组蛋白的均质性很低，这种异质性源于哺乳动物复合型N-多糖合成的多步骤过程。

图2 真核细胞中存在的天然糖基化修饰示意图Fig.2 Schematic diagram of antibody glycosylation modification in eukaryotic cells

2.1 糖疫苗的生产及优化

对于大多数传染病，目前的方法还是以疫苗预防为主。常规细菌性疫苗主要包括灭活苗、弱毒苗、类毒苗、多糖疫苗及糖结合物疫苗(提取细菌、病毒的特殊蛋白结构，筛选具有免疫活性的片段)等。多糖疫苗是由于多糖的免疫原性，可将细菌特异性的多糖纯化后制成的疫苗，但因为其免疫原性较弱，应用性受到限制。糖结合物疫苗主要由载体蛋白、聚糖抗原和佐剂三部分组成。机体遇到特定聚糖如细菌荚膜多糖O-抗原(通常是由较小糖基序的重复单元组成)会出现相应的免疫反应，载体蛋白可以作为免疫佐剂与多糖共同配制或共价连接增强机体对疫苗的免疫应答[20]。自1980年，第一支利用B型流感嗜血杆菌荚膜多糖预防其感染的抗菌糖疫苗获得批准以来，糖结合物疫苗的研发在预防疾病方面已经取得很大的进步[21]。

2.1.1 大肠埃希菌体内生产糖疫苗 迄今为止，在大肠埃希菌体内生产的糖结合物疫苗主要包括预防1型痢疾链球菌、2a型福氏志贺菌、土拉热弗朗西斯菌等细菌的感染(表1)。目前此方法以低廉的成本和更为安全的生产环境成为热门研究方向。该方法又称生物偶联或蛋白聚糖偶联技术(protein glycan coupling technology，PGCT)，主要是由LLO生物合成、载体蛋白和OST的表达以及体内糖偶联几个步骤组成[22]。2004年利用PGCT技术和化学方法针对B型流感嗜血杆菌治疗肺炎脑膜炎的第一支糖结合物疫苗(Hib)在古巴批准使用[23]。后来，利用此技术成功生产出了针对2a型福氏志贺菌[24]、肠致病性大肠埃希菌[25]、假马氏伯克霍尔德氏菌[26]、O157型大肠埃希菌[27]、土拉费朗西斯菌[28-29]、金黄色葡萄球菌[30]和肺炎链球菌[31-32]的多种糖结合物疫苗。另一方面由于pglB对于糖供体底物有较为严苛的底物特异性使O-连接的OST无法在菌体内生产糖结合物疫苗。目前已开发多种属OST，如脑膜炎耐瑟菌来源的pglL可用于生产针对2a型福氏志贺菌[33]和肠伤寒沙门氏菌血清型[34]，而结核分支杆菌来源的pglS则可用于生产针对肺炎链球菌[35]和致病性肺炎克雷伯菌的糖结合物疫苗[36]。

表1 细菌糖工程方法生产细菌糖结合物疫苗

对比化学方法合成疫苗的生产方式，在工程菌株体内合成糖疫苗等具有许多优点。首先，通过基因工程改造可以使多糖选择性增加，其次整个糖结合物疫苗的产生过程可以转移到大肠埃希菌工程菌体内[38]，表明糖疫苗可以完全不涉及病原菌体而进行生产。多糖成分和转运蛋白均在菌体内链接，意味着在糖复合物产生前不需用任何纯化步骤，并且蛋白表达的纯化过程也因为可控性高而变得更加经济高效。将不同质粒(分别携带编码pglB、合成寡糖链所需酶、受体蛋白的基因)共转化入大肠埃希菌工程菌株体内并诱导表达成功，就可以得到糖蛋白复合物；若受体蛋白或多糖需要更换，只需更换相应质粒，就可以高效表达相应糖结合物。

2.1.2 利用细菌外膜囊泡生产糖疫苗 糖结合物疫苗还能以细菌外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMV)与糖链结合方式生产。OMV是一种由革兰阴性杆菌外膜释放的脂质体(20～200 nm)，其组成成分与细菌外膜相似，包括膜蛋白、荚膜多糖、脂寡糖、脂多糖以及质周腔的一些成分等[43]，具有很强的免疫原性[44-46]。此外，OMV还具有免疫佐剂的特性，使其制作为疫苗更为简便[47-48]。目前，天然的OMV携带的免疫原性蛋白可与外膜蛋白基因融合以重组的形式表达在OMV的表面或质周腔中，并未改变免疫原性[47,49]。这种利用细菌糖工程方法并基于OMV的形式生产的糖结合物疫苗，即将具有免疫原性的多糖重组展示在OMV的表面，具有以下优点：①在第二糖基转移酶基因WbbL[50]中插入IS元件使菌株失去生成O-抗原多糖的能力并可保留翻转酶和连接酶基因在内的其余机制；②大肠埃希菌体内可以重组表达非天然多糖；③O-抗原连接酶Waal的糖特异性较差，可在缺乏天然O-抗原的细胞中将工程多糖从und-PP转移到脂质A中[51]；④重组O-抗原可被运送至细胞表面并以OMV的形式释放。

2.1.3 利用大肠埃希菌生产糖疫苗的优化 一些糖结合物疫苗需要佐剂的参与从而增强机体发生免疫反应的强度。但是大多数佐剂疫苗为免疫刺激分子和抗原的共制剂，这些分子在体内容易分离，佐剂的作用可能会丧失。最近发现：①一些聚糖可以使位点特异性修饰的糖蛋白缀合物识别自身表位，如α-Gal基序，从而在与各种肽、蛋白质、全细胞和基于纳米颗粒的免疫原结合时发挥免疫佐剂的作用[52-57]，可以有效提高疫苗有效性，有助于新疫苗的开发应用，可以使生产的疫苗具有靶向树突状细胞上的DC-SIGN受体，然后通过MHC I类限制和II类限制呈递抗原，最终使抗原特异性抗体的滴度增加[58]；②类人源寡糖链中的Sia2-3Gal结构通过与巨噬细胞表面的siglec1(Sn，CD169)结合来实现抗原的靶向和内吞作用，最终致使向T细胞呈递的抗原增加[59]。

2.2 糖重组蛋白表达及优化

N-糖基化修饰可以增加治疗性蛋白的稳定性和体内循环时间[60]。虽然糖基化修饰对每种蛋白质的影响可能不同，但研究显示N-糖基化修饰可通过以下方式改善蛋白的理化性质：①通过屏蔽非结构化、疏水性或易于蛋白酶作用的蛋白质区域来防止变性、聚集和降解[60]；②增加分子的分子量和流体动力学半径以减少肾滤过[61]； ③去除免疫原性，减少免疫系统清除[62]；④覆盖或去除可被人凝集素识别/清除的末端结构[63]。下文简要总结了利用大肠埃希菌构建不同N-糖基化修饰途径合成治疗性糖蛋白、优化理化性质的几个应用实例(图3)。

图3 利用大肠埃希菌生产N-糖基化重组蛋白的途径示意图Fig.3 Schematic diagram of the production of N-glycosylated recombinant proteins using Escherichia coliA:在大肠埃希菌内N-糖基化修饰重组蛋白途径；B:无细胞糖蛋白合成途径A:Recombinant protein pathway modified by N-glycosylation in Escherichia coli; B:Cell-free glycoprotein synthesis pathway

2.2.1 胞质内合成途径 目前在胞质中构建的N-糖基化修饰蛋白途径多是基于NGT构建的非OST依赖系统。Yates等[64]于2019年利用糖基转移酶ApNGT在胞质中构建了类人源寡糖链三糖(Neu5Ac-α-2,3-Gal-β-1,4-Glc-)的合成途径，可以进一步被来源于不同种属的糖基转移酶等(包括脂寡糖、脂多糖和荚膜多糖合成途径来源的酶)延伸，最终形成多聚唾液酸修饰的糖蛋白复合物等，其多聚唾液酸聚合度为10～80，糖基化效率为20%左右。但是该方法需要外源添加价格昂贵的Neu5Ac，菌体也需进一步进行代谢途径改造。由 NGT 转移的单个葡萄糖残基可通过葡萄糖聚合酶(α-1,6 GlcT)延伸成葡聚糖聚合物[65]；或形成Glc短肽后进一步联合应用化学-酶法，通过内切糖苷酶的转糖基作用产生高甘露糖型或唾液酸修饰的平分型GlcNAc[66-67]。研究表明在生产单克隆抗体糖复合物时，与使用空肠弯曲杆菌pglB糖基化识别序列相比，使用此酶识别N-X-T糖基化序列可缩短蛋白糖基化反应时间，虽然糖基化效率没有相应提高，但使得在大肠埃希菌体内建立人源化N-糖基化修饰途径(如完全人源化聚唾液酸修饰糖蛋白)逐步得到实现[68]。

2.2.2 质周腔合成途径 目前在质周腔构建的N-糖基化修饰蛋白途径大多是基于CjpglB构建的OST依赖系统，近10年来先后生产了均质性较高的原核生物七糖(GalNAc-α-1,4-GalNAc-α-1,4-[Glc-β-1,3-]GalNAc-α-1,4-GalNAc-α-1,4-GalNAc-α-1,3-Bac-β1)[1]、真核生物核心五糖(Man3GlcNAc2)[17]、类人源四糖(Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,3-GlcNAc-)[69]及末端唾液酸化类人源五糖(Neu5Ac-Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,3-GlcNAc-)[70]等(表2)寡糖链修饰的多种N-糖基化重组蛋白，如单链抗体、单体拟抗体及骨架蛋白等[71-72]。 胡学军课题组于2017年以流感嗜血杆菌寡糖合成机制和空肠弯曲杆菌寡糖翻转酶和寡糖转移酶为基础，建立了高效的类人源化四糖链N-糖基化修饰重组蛋白系统，优化后N-糖基化修饰效率可达到100%[69]，增加了重组蛋白稳定性[71]；并于2020年进一步以空肠弯曲杆菌唾液酸合成酶基因簇NeuBCA和多种微生物来源的唾液酸转移酶为基础，首次在大肠埃希菌中构建了末端唾液酸修饰类人源化N-糖基化寡糖链(Neu5Ac-α2,6/2,3-Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,3-GlcNAc)合成途径[70]，此寡糖链长度和天然的单天线寡糖长度相近。该系统的优势是在大肠埃希菌中构建了唾液酸合成及活化途径，菌体可自主生产唾液酸修饰所需昂贵的一磷酸胞嘧啶唾液酸(CMP-Neu5Ac)，大大降低了生产成本。有研究表明唾液酸修饰重组蛋白可提高其可溶性等多项生物物理性质，α-2,6唾液酸化N-糖基化修饰重组蛋白可显著增加其体内半衰期。

表2 利用大肠埃希菌合成的均质性糖链

2.2.3 胞外分泌合成途径 为了实现利用大肠埃希菌进行N-糖基化修饰重组蛋白的规模化生产，不仅需要解决上述糖基化效率低问题，还需在降低生产成本及提高总产量方面取得突破性进展。利用大肠埃希菌细胞工厂进行胞外分泌生产糖基化蛋白具有显著优点，如正确折叠重组蛋白，提高产量及便于分离纯化等。虽然YebF等分泌蛋白可以携带重组N-糖蛋白进入培养基，但随后的酶消化或下游变性是必需的步骤[73]，因此不利于提高蛋白质的稳定性和简化下游纯化步骤，然而这对于减低重组糖蛋白的生产成本是非常重要的。在质周腔中表达重组蛋白因为空间限制等原因，往往远远低于在胞质内的表达量。但是CjpglB只有在大肠埃希菌质周腔中才能进行N-糖基化修饰重组蛋白，所以重组蛋白需由信号肽定位到质周腔，结果导致糖蛋白产量受限。另一方面当N-糖蛋白在渗漏型大肠埃希菌质周腔表达时，此受体蛋白可能在被CjpglB识别之前就泄漏到胞外，不能及时与寡糖链连接，从而引起糖基化效率的总体降低。胡学军课题组于2019年应用自动诱导培养方法结合敲出外膜脂蛋白lpp基因大肠埃希菌菌株，糖基化效率从目前报道的30%～75%，提高到100%。通过该技术糖基化小分子抗体总产量提高了3～5 倍，并且可以使糖基化抗体直接分泌到培养基中，分离纯化时不再需要破碎细菌[71]，可直接从培养基中分离纯化糖基化的抗体片段，大大简化了下游分离纯化程序，建立了高效生产糖基化重组蛋白技术平台，为该技术走向应用奠定了基础。

2.2.4 cell-free合成系统 无细胞蛋白合成(cell-free protein synthesis，CFPS)系统突破活细胞限制，利用大肠埃希菌裂解物、氨基酸、核酸及辅助因子等，在试管中进行蛋白质合成反应[74]。CFPS系统始于1958年，Hoagland等首次脱离活细胞结构调节蛋白质合成[75]，随后CFPS被用于氨基酸遗传密码子破译[76]。基于大肠埃希菌粗裂解物的无细胞蛋白合成技术在21世纪中期快速广泛发展，建立了反应成本低[77]、可持续运行[78]、产量可达(2.67±0.06) g/L的蛋白质合成系统[79]，并突破技术瓶颈获得膜蛋白[80]、含非经典氨基酸蛋白[81]、含二硫键蛋白等可正确折叠的蛋白质产物[82]。CFPS兼得细菌体内及体外合成系统的优点，使复杂生物分子的生产研究更加高效、可控、易操作，在糖蛋白合成领域具有很大的应用前景。Guarino等[83]、Jaroentomeechai等[84]在2011年首次将纯化的CjpglB和LLOs引入基于大肠埃希菌的CFPS反应中，开发了“单锅法”无细胞糖蛋白合成平台(Cell-free Glycoprotein Synthesis，CFGpS)，实现目标蛋白体外合成和糖基化修饰同时完成。目前，CFGpS平台可合成包括空肠弯曲杆菌七糖及真核生物核心五糖修饰在内的多种聚糖，并已应用于糖复合疫苗合成[85]。Schoborg等[86]将脂质纳米盘作为细胞膜模拟物，利用CFPS系统高效产出多种活性构象的OSTs，可识别不同N-糖基化受体序列，完成多种靶蛋白体外N-糖基化修饰，省去OSTs在细菌中表达、纯化及加工等步骤。此外，基于CFPS系统合成NGTs、OGTs、GalNAcTs等糖基转移酶并脱离活细胞完成体外糖基化修饰，建立了非OST依赖的无细胞糖基化体外修饰新途径[87-89]。其中，GlycoPRIME(Glycosylation Pathway assembly by RapidInvitroMixing and Expression)体外糖基化途径通过CFPS富集GTs并以模块化混合匹配的方式进行靶蛋白糖链合成，已实现37种由ApNGT起始的糖链合成途径并获得23种不同的聚糖结构[13]。

3 展 望

目前，利用大肠埃希菌解决了均质性修饰N-糖基化修饰重组蛋白问题。该技术有望首先在糖疫苗生产方面得到产业化应用。利用大肠埃希菌生产N-糖基化蛋白主要问题一是表达宿主稳定性差，二是目的蛋白总表达量偏低。

有研究表明可通过敲除大肠埃希菌的外膜蛋白基因或筛选高效的信号肽系统，使糖基化重组蛋白分泌至培养基中，解决菌体代谢负担过重问题，可提高重组蛋白产量。采用cell-free系统实现“一锅法”反应方案，将蛋白质的生物合成与天冬酰胺连接的蛋白质糖基化在体外完成，这一方法能否大规模生产糖基化重组蛋白，有待于进一步研究。

大肠埃希菌体内生产的多数N-糖基化重组蛋白是通过多质粒系统完成的，造成菌株稳定性差，使生产N-糖基化重组蛋白产量低。根据合成生物学成功经验，将编码不同功能模块的基因簇整合在大肠埃希菌的基因组上，通过优化不同模块间表达水平，形成稳定的高效生产目标产物的宿主细胞，是提高目标产物有效方法之一。这一方案能否应用于大肠埃希菌N-糖基化修饰重组蛋白生产来解决菌株稳定性问题有待深入研究。

2022 年初，Terra等[4]将空肠弯曲杆菌来源的编码寡糖转移酶pglB基因整合到大肠埃希菌基因组上，发现能提高菌株稳定性。将N-糖基化过程中执行各种功能的模块，包括唾液酸合成与修饰功能模块、寡糖合成功能模块、寡糖修饰重组蛋白功能模块整合到大肠埃希菌基因组上，通过优化各模块功能，构建各模块间功能协调作用，有望能构建成高效、大规模生产N-糖基化重组蛋白的底盘细胞。根据文献报道，这一方法是非常值得尝试的解决宿主稳定性的方案。