β-烟酰胺单核苷酸合成研究进展

景占煜， 袁若珂， 李益民， 袁文杰, 3*

(1.大连理工大学 生物工程学院，辽宁 大连 116023；2.四川农业大学 生命科学学院，四川 雅安 625014；3.大连理工大学 宁波研究院，浙江 宁波 315016)

β-烟酰胺单核苷酸(NMN), 其分子式为 C11H15N2O8P，分子量 334.2。NMN在人体内天然存在，也富含在一些水果、蔬菜和肉类中。作为辅酶I (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD+)的前体物质，NMN是细胞内一个重要的代谢中间产物(图1)。NAD+是生物机体组织必需的一种辅酶，在生物氧化过程中起着传递氢、活化多酶系统、促进核酸、蛋白质、多糖的合成及代谢，提高物质转运和调节控制，改善代谢功能的作用。许多基本的生物学过程，包括寿命调节、DNA修复、细胞凋亡、端粒维持都与NAD+相关[1]。随着年龄的增长，NAD+的水平逐渐降低，细胞反应和代谢减弱，由此带来一些问题，比如长皱纹、脱发、精力变差、易疲劳等。近年来, 人们对NAD+作为中枢信号分子和酶底物的作用越来越感兴趣。通过提高体内NAD+的水平，可补充体力、抗氧化、提高细胞ATP能量等。外源摄取NMN是补充NAD+最直接、最有效的手段，因此近年来NMN的生物学作用备受关注。NMN在人体内通过转化为NAD+发挥其生理功能，对心脑血管疾病、神经退行性疾病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用，并且能调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等[2-3](图2)。鉴于上述的生物活性，NMN被称之为不老神药，成为药品、保健品和化妆品等领域的研究热点。世界范围内(尤其是美国)正在进行的临床实验达到15项，其中5项已完成[4]。本文对国内外有关NMN在疾病治疗中的应用及NMN的合成工艺进行较为详细的综述，为后续NMN的高效、低成本合成提供参考。

图1 NMN与NAD+的结构示意图Fig.1 Structure diagram of NMN and NAD+

图2 NMN的生物学作用Fig.2 Biological function of NMN

1 NMN在疾病治疗中的应用

1.1 NMN具有提高认知和记忆功能的作用

NMN具有改善认知和记忆功能的作用，对阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)和帕金森病等中枢神经系统病变性疾病有一定的治疗作用[5]。AD患者会发生认知功能障碍和记忆损害。线粒体结构和功能异常是AD的发病原因之一。研究发现，当提高机体内NMN水平后，NAD+可用性随即增高，促进了线粒体的融合，改善了线粒体的呼吸功能[6]。NMN 通过改变物质代谢过程中伴随的能量转移、存储等，防止机体内氧化和抗氧化的失衡，改善了由于淀粉样蛋白质(Aβ1-42低聚体)大量积累而导致的AD大鼠的认知和记忆功能，减少了AD小鼠海马切片中活性氧自由基(ROS)的积累[7]。此外研究还发现，NMN通过激活丝氨酸苏氨酸激酶(JNK)，改善AD小鼠的行为认知障碍，抑制β-淀粉样蛋白生成，减轻神经系统淀粉样斑块负荷、突触损伤和炎症反应[8]。调节细胞内NMN水平，可以改善心脑血管疾病、神经退行性疾病以及老化退行性疾病，并具有一定的治疗和修复作用[9-13]。

1.2 NMN具有改善肥胖、糖尿病代谢异常的作用

NAD+水平随着年龄和生理状况的变化而下降，这与肥胖、糖尿病代谢异常等有关。最近有人对使用NAD+促进剂包括NMN和烟酰胺核糖(NR)治疗代谢障碍的药理学进行了研究[14-15]。肥胖、糖尿病和衰老会引起细胞内NAD+水平下降，导致代谢功能障碍。在哺乳动物NAD+生物合成中，NMN的有效性是一个限速因子。NMN通过催化哺乳动物NAD+的生物合成，参与和调节机体的内分泌，从而起到保护和修复胰岛功能、增加胰岛素分泌，防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病的作用。NMN可作为一种治疗过度营养导致孕妇及产后代谢性疾病的药物[16]。通过注射NMN，仅18 d就可改善糖耐量，降低脂质积累，上调负责肥胖雌性后代的脂肪酸代谢基因表达。一项为期10周的实验评估了补充NMN对超重或肥胖绝经后前驱糖尿病女性代谢功能的影响。实验结果发现，骨骼肌胰岛素信号在补充NMN后增加，并上调了血小板源性生长因子受体b等与肌肉重塑相关基因的表达，证明NMN增加了超重或肥胖的前驱糖尿病女性患者肌肉胰岛素敏感性，影响了胰岛素信号传导和重塑[17-18]。

1.3 NMN具有改善与年龄相关的生理衰退的作用

NMN能够显著改善小鼠与年龄相关的生理衰退，如抑制与年龄相关的体重增加，增强能量代谢，改善胰岛素敏感性和血浆中脂质分布，改善眼部功能[19]。NMN能通过组织特异性方式预防与年龄相关的基因表达变化，并且增强骨骼肌中的线粒体的氧化代谢，部分地介导抗衰老作用[20]。长期来看，在饮用水中加入NMN成功地逆转了与年龄相关的体重增加，改善了能量代谢和胰岛素敏感性[21]。另外健康超重或肥胖的男性和女性，添加NMN持续6周，可增加骨骼和肌肉中NAD+代谢，影响骨骼肌肉中乙酰肉碱代谢，达到去脂减肥的目的[22]。

1.4 NMN其他方面的作用

提高NMN水平还可以降低梗死组织中血红蛋白含量，减轻出血和水肿，降低由氧化应激造成的脑组织氧化毒性损伤，增加心脏中NAD+和NADH的含量[23]，恢复心脏缺血时心肌细胞中的NAD+水平，提高了组蛋白脱乙酰酶(又称沉默调节蛋白，Sirt1)的脱乙酰酶活性和与丝裂霉素功能相关的基因表达水平，具有很好的临床应用前景[24]。

NMN在美容方面的应用也是近年来的研究热点。NMN能提高细胞内线粒体功能，阻止自由基引起的细胞损伤，从而延缓细胞衰老，提高表皮细胞以及人体内其他细胞的功能，维持皮肤健康，延缓皮肤衰老[25-27]。

2 NMN的合成方法

虽然NMN广泛存在于毛豆、西兰花、真菌、虾等天然食物中，但是通过食用天然食物摄入NMN 的量，远不能达到对人体健康造成关键性影响的水平[28]。因此将其人为添加，应用于加工食品，可以在改善人体健康、预防疾病等方面起到重要的作用。化学法、微生物发酵法及生物酶法均可以合成NMN，但目前报道最有前途的应为生物酶法。

2.1 NMN的化学法合成

化学法合成NMN有多种工艺[29-32]，其中最普遍的是以烟酰胺(NAM)为起始物料经过三甲基硅烷保护后和四乙酰基核糖催化缩合得到三乙酰基烟酰胺核苷三氟甲磺酸盐，经离子交换得到三乙酰基烟酰胺核苷氯化物，再碱水解结晶得到烟酰胺核苷氯化物，经磷酸化处理，得到β-烟酰胺单核苷酸。虽然技术容易控制，但产品杂质过多，分离纯化困难且总体收率很低，而且有机溶剂用量较大，对环境污染的影响不可忽视。此外，四乙酰核糖与烟酸乙酯(或烟酰胺)的缩合均使用价格昂贵的促进剂 TMSOTf，导致化学法合成NMN成本仍较高。

2.2 NMN的微生物法合成

微生物发酵法是通过微生物的生长积累合成磷酸核糖焦磷酸(PRPP)，外加NAM在细胞内烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的作用下，生成NMN。微生物发酵法中以高产菌株的选择最为重要。Kazane[33]以烟酰胺核糖(NR)营养缺陷型酵母为辅助筛选工具，从174株乳酸杆菌中获得3株产NR或NMN的兼性厌氧乳酸菌。经16S rRNA 鉴定这三种候选微生物均属于果糖芽胞杆菌属(Fructobacillus)，并能在培养基中产生NR (2.4～4.5 μmol/L)。因为厌氧乳酸发酵使用D-果糖作为电子受体，培养基中添加果糖后，生物量可以增加5倍。通过基因组测序，研究者获得了能够产生NMN和NR的关键酶——Nampt。

赵丽青等[34]从生产NMN相关产品的工厂下水管道附近的土壤中，经初筛和复筛，筛选出转化烟酰胺生成NMN能力较强的菌株，命名为革兰阴性菌成都肠杆菌(Enterobacterchengduensis)2021T4.7。该菌株以NAM为诱导物，经过培养基和培养条件优化，NMN产量最高为67.66 μmol/L。

为进一步提高微生物发酵法生产NMN的浓度和效率，研究者尝试了通过构建基因工程菌来达到目标。Marinescu等[35]在大肠埃希菌(Escherichiacoli)中单独表达分别来源于家鼠(Musmusculus)、 希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)和软性下疳杆菌(Haemophilusducreyi)的 Nampt，补加底物 NAM，边发酵边合成 NMN。结果发现，相对于其他两个细菌来源的 Nampt，相同时间内哺乳动物(家鼠)来源的 Nampt在大肠埃希菌表达后合成 NMN 的产量较低，其中单独表达来源Haemophilusducreyi的Nampt 的大肠埃希菌，发酵12 h，NMN 产量最高可达 0.042 mmol/L。在此研究基础上，增加来源于Bacillusamyloliquefaciens的核糖磷酸焦磷酸激酶(Prs)，有利于菌体 PRPP 的生成。优化培养条件后，发酵 12 h，NMN产量最高可达0.046 mmol/L。

基于之前的研究，Black等[36]在大肠埃希菌内构建了3条不同的NMN的合成途径。实验结果表明，通过过表达来源于Ralstoniasolanacearum的磷酸核糖转移酶(NadV)，可将NMN的产量提高到1.5 mmol/L。值得注意的是，通过加强底物的转运和产物的转出，重组大肠埃希菌发酵NMN的最高浓度提升了近1 000倍，达到20.3 mmol/L[37]。该研究首先比较了来源于不同微生物的Nampt 活性，发现Sphingopyxissp. C-1 (SSC)和Chitinophagapinensis(CP) 的酶活性较高，并选择来源于Chitinophagapinensis(CP)的Nampt用于后续研究。7个大肠埃希菌的内源基因 (pgi、zwf、pgl、gnd、rpiA、rpiB、prs) 被过表达，加强了从葡萄糖到PRPP 的合成，提高了细胞内PRPP的浓度。然后比较了6个不同来源的烟酸转运蛋白NiaP 来加强胞外NAM的转运，发现来源于Burkholderiacenocepacia(BC) 的NiaP基因效果最好。又比较了5个不同来源的NMN转运蛋白，发现PnuC-BM效果最好。综合以上结果，构建的基因工程菌在OD600为40, 在含有21 g/L 葡萄糖、7 g/L NAM的M9 培养基中反应8 h, NAM转化率达到86%，为目前文献报道的微生物发酵法合成NMN的最高水平。

2.3 NMN的生物酶法合成

生物酶法使用纯化的游离酶或固定化酶催化合成NMN。由于反应时间短、生成的NMN浓度高，是更有利于工业化的生产工艺。生物酶法生产工艺主要分为两类：一类是基于磷酸核糖焦磷酸工艺，一类是基于烟酰胺核糖工艺。每一大类中又包括三种方法。

2.3.1 以磷酸核糖焦磷酸为核心的工艺 ①PRPP和NAM通过Nampt制备NMN。廖一波[38]将来源于Comamonadaceaebacterium的 Nampt进行单酶催化合成NMN。结果显示，单酶法合成NMN，通过补加一次底物 PRPP，10 min，NMN 产量达到0.1 mmol/L，转化效率为 204 mg/(L·h)。傅荣昭等[39]以NAM、焦磷酸或其盐以及AMP为原料，在Nampt和腺嘌呤磷酸核糖转移酶的催化作用下，获得烟酰胺单核苷酸，避免了反应中使用不稳定底物PRPP。这个反应的关键酶来自MeiothermusruberDSM 1279 的Nampt。经人工诱导定点突变获得的突变体酶活力大大提高，是亲本的1.2～6.9倍。在150 mmol/L NAM、100 mmol/L焦磷酸钠等条件下，50 ℃，pH值8.0～8.5反应8 h后，即得NMN粗产品溶液(含NMN 96.5 mmol/L)，再经过滤、纯化、干燥后即得NMN成品。同时，本研究也报道了使用固定化酶的催化作用。使用酶固定化载体环氧型 LX 3000 (50 mg酶/g载体)，150 r/min，25 ℃反应20 h制备固定化酶。在含75 mmol/L的NAM、75 mmol/L的焦磷酸二钠，37 ℃，pH值7.0～8.0条件下，反应5 h后即得NMN粗产品溶液(含NMN 48.8 mmol/L)。 ② 以NAM、核糖和ATP为底物，经D-核糖激酶(Ribokinase，EC2.7.1.15)、Prs和Nampt催化反应生成NMN。180 min时，NMN最高产量为0.071 mmol/L，转化效率为8 mg/(L·h)[37]。傅荣昭等[40]考察了使用固定化的酶进行类似的反应。在30 mmol/L的NAM、20 mmol/L的ATP、30 mmol/L的核糖条件下，加入固定化了的10 g/L的Nampt、Prs、核糖激酶(Rbks)等，37 ℃，pH 7.0～7.5条件下，反应4 h可以获得NMN粗产品溶液，浓度达到10 mmol/L。③ 以NAM、ATP和木糖为原料，在Nampt、Prs、核糖-5-P异构酶、核酮糖-3-P异构酶、木酮糖激酶(XK)以及木糖异构酶(XI)等多种酶的催化作用下，也可获得NMN[41]。在150 mmol/L NAM、50 mmol/L ATP和木糖，pH 8.0～8.5条件下，加入Nampt等酶各100 g/L，8 h后，获得NMN 22 mmol/L。 由上述合成路线可知，基于PRPP反应，Nampt活性为限速步骤。并且Nampt催化可逆反应，合成NMN同时也能水解NMN，反应转化率较低。同时，中间体PRPP化合物不稳定，不利于反应进行。整条工艺路线需要消耗大量的ATP，导致该生物催化法的生产成本较高。

图3 基于磷酸核糖焦磷酸的工艺示意图Fig.3 Process diagram based on phosphoric ribose pyrophosphate

2.3.2 基于烟酰胺核糖的工艺 ①以烟酰胺核糖(NR)为原料，通过烟酰胺核糖激酶(Ribosylnicotinamide kinase，EC 2.7.1.22)在ATP供应下生成NMN。肖春英[42]利用来自ThermothielavioidesterrestrisNRRL 8126烟酰胺核糖激酶，在60 mmol/L NR、60 mmol/L ATP条件下，70 ℃，pH 5.0反应4 h，NMN的转化率达93%。为提高烟酰胺核糖激酶(NRK)的热稳定性，研究者们进行了不同的基因突变。中国专利CN110373398A[43]公开了一种来源于马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)的NRK突变体，在氨基酸序列第D45位、第D58位、第R161位、第Y164位进行单突变、两两联合突变、三个联合突变或四个联合突变，并将该新型NRK突变体工业酶用于NMN的合成。将5 g底物NR溶解于100 mL、50 mmol/L pH 6.0磷酸钠缓冲液中，待底物完全溶解后加入50 mmol/L 六偏磷酸钠、5 mmol/L ATP、50 mmol/L 氯化镁、0.2 g NRK突变体(D45E/D58Q/R161K/Y164W)冻干粉、0.2 g 多聚磷酸激酶PPK2冻干粉，25 ℃反应20 h后，底物转化率>80%。来源于Homo sapiens的野生型NRK，先通过蛋白结构自由能计算预测出可能与提高稳定性有关的15个位点，然后分别进行实验研究。获得的突变体，在10 mmol/L ATP，10～100 g/L NR条件下，42 ℃反应3 h后，反应转化率>99%。与野生型酶相比，NRK突变体热稳定性显著提高，45 ℃加热20 min后，剩余酶活由之前的14.05%增加到突变体的76.24%；同时，突变体的单位酶活相对于突变前提高了2.77倍，从而显著提升了酶的反应温度，加快了反应速率，降低了反应时间和生产成本，有效延长了酶的保存时间，降低了酶的使用成本[44]。此外，通过表面展示的方法构建的全细胞催化剂也可用于NMN的生物酶法合成[45]。将酿酒酵母絮凝集素锚定蛋白flo1和NRK串联形成融合蛋白，将该融合蛋白的编码基因定向插入S1中酿酒酵母展示表达载体pHBM368-pgk以pgk为启动子的开放阅读框中，经载体的线性化和电转化，将目的基因导入底盘细胞酿酒酵母中，目的蛋白表达后，通过凝集素锚定蛋白flo1将NRK成功展示于酿酒酵母细胞壁表面，形成具有催化功能的全细胞酶催化剂；该酶40 ℃反应4 h可生成49.2 mmol/L NMN，转化率达到98.3%，适合工业化生产。②以腺苷和磷酸盐为起始，在腺苷激酶(PNP)和NRK酶组合物的催化下生成D-核糖-1-磷酸和烟酰胺核糖中间体，最后获得NMN[46]。腺苷和磷酸盐在PNP的作用下首先合成D-核糖-1-磷酸，并继续在该酶的催化下，与NAM合成烟酰胺核糖，然后消耗1分子ATP在NRK的催化下不可逆反应生成NMN。整个反应体系需要两种酶的参与，生成1分子NMN的同时，只需消耗1分子ATP，且加入多聚磷酸激酶实现ADP再生为ATP，整个工艺大幅降低了成本。在135 mmol/L 腺苷、135 mmol/L NAM、200 mmol/L MgCl2、20 mmol/L ATP、135 mmol/L多聚磷酸钠等条件下，加入PNP、NRK粗酶液，35 ℃反应24 h，生成NMN 128.2 mmol/L(42.8 g/L)，底物转化率达到95%，NMN的浓度和转化率均达到了文献报道的最高水平。③以D-核糖、NAM为底物，在RbKs、磷酸核糖变位酶及NRK的催化作用下合成NMN[47]。D-核糖在RbKs的作用下合成核糖-5-P；在磷酸核糖变位酶的作用下生成核糖-1-P，然后在1-P-核糖解磷酸酶的作用下合成NR；NR在NRK的磷酸化作用下合成NMN。在反应体系中依次加入终浓度为100 mmol/L的核糖，100 mmol/L的NAM，120 mmol/L ATP，以及固定化的RbKs、NRK、磷酸核糖变位酶等各32 g/L，25 ℃反应4 h得到NMN 92 mmol/L，反应收率92.51%。以上结果表明，基于NR为原料的NMN合成工艺，底物转化率高，生成的NMN浓度高。但直接以NR为底物，价格昂贵，成本不具有优势。以腺苷(Adenosine)和核糖(Ribose)为底物，通过二步或三步酶反应，均可以获得转化率高(>90%)、NMN浓度高的结果，而且成本低，适于大规模化工业生产。但从文献报道的结果来看，酶活力不足导致的酶用量较大(32 g/L)，急需寻找酶活力更高的编码基因或通过蛋白质工程的方法获得高活性酶蛋白，进一步降低生产成本，使这种具有超常生物活性的产品惠及更多人群。

图4 基于烟酰胺核糖(NR)的工艺示意图Fig.4 Process diagram based on nicotinamide ribose

3 展 望

最近的临床研究发现，做为NAD+最理想的补充剂，NMN在多种人类疾病如糖尿病、肥胖、缺血再灌注、心力衰竭和心肌病、血管功能障碍、脑内出血、神经保护和认知功能、阿尔茨海默症(AD)、视网膜变性、角膜损伤、急性肾损伤、酒精性肝病的小鼠模型治疗中已显示出较高的疗效和效益，并具有安全无毒、无明显副作用以及耐受性良好等特点。一些NMN胶囊配方作为保健品已被批准并投放市场，但目前NMN的价格居高不下，限制了其大范围使用。从NMN的制备工艺来看，虽然近几年微生物发酵法取得了巨大的进步，NMN的产量由不足5 μmol/L提高到了20 mmol/L，但与生物酶法相比，底物NAM的转化率和产物NMN的浓度依然偏低，仍具有较大的提升空间。通过基因编辑技术，提高微生物细胞内PRPP的浓度是目前提高NMN浓度的主要研究方向[48]，NAM和PRPP在Nampt的催化下生成NMN。采用合成生物学策略，筛选外源高活性Nampt，并增加前体PRPP和ATP的供应，从而提高菌株的生产性能。但PRPP对微生物有毒，可能是限制其高浓度积累的瓶颈。PRPP浓度与Nampt活性的匹配是使用全细胞重组大肠埃希菌催化合成NMN的关键。此外，在这个体系中，底物NAM和产物NMN的快速进出细胞也是影响反应速率的重要因素。通过过表达转运蛋白YgcS，提高了NAM进入细胞的速率和转化率。同时，NR的转运蛋白(PnuC)的过表达会进一步提高NMN的合成效率。

生物酶法采用游离酶或固定化酶进行的体外催化合成NMN反应，转化率高，NMN产物浓度高，底物便宜，是比较理想的制备NMN的方法。尤其是基于腺苷或核糖和NAM合成NMN的方法，产物转化率达到了90%以上，浓度也高达200 mmol/L以上[44]，但该方法目前仍存在多种酶使用量大的问题。因此，ATP的循环使用以及各生物酶的高活性及高稳定性是保证NMN能够高效、低成本生产的关键。ATP的循环使用，可采用多聚磷酸激酶(PPK2)来实现。NRK的稳定性和高活性的提升，可以通过蛋白质工程来进行，但这也是非常有挑战性的工作。固定化是提高酶的重复利用和提高酶的抗逆性的一种重要手段。基于微生物细胞表面展示的酶并同时进行细胞自固定化策略，无需采用固定化材料，含有NRK的全细胞便可行固定在特殊的反应器中，从而实现NR到NMN的连续化合成，提高了生产效率[45]，但这个反应过程中直接使用ATP供能，提高生产成本。可通过基因编辑方法，在大肠埃希菌或酿酒酵母细胞内，通过过表达解磷酸酶和PNP或RbKs，增加腺苷和核糖代谢途径的通量，在此基础上，进一步调整底物和产物的转运蛋白增加转运速率。使用该全细胞进行NMN的合成，一方面可以减少ATP的用量，另一方面也可以进行重组细胞的重复使用，从而进一步降低生产成本。笔者所在大连理工大学合成生物学与生物催化转化课题组建立了基于细胞自固定化策略的NRK表达系统，无需采用固定化材料，含有NRK的全细胞便可形成毫米级颗粒，并固定在特殊的反应器中，在PPK2的作用下，使用多聚磷酸盐供能，从而实现腺苷或核糖到NMN的连续化合成。