不同光质对红花檵木愈伤组织生长及黄酮类物质含量的影响

郭佩瑶，邓斯颖，张艺帆，许 璐，于晓英,3*，李炎林,3

(1 湖南农业大学 园艺学院，长沙 410128；2 湖南省中亚热带优质花木繁育与利用工程技术中心，长沙 410128；3 教育部园艺作物种质创新与新品种选育工程研究中心, 长沙 410128)

红花檵木(Loropetalumchinensevar.rubrum)属于金缕梅科檵木属的常绿灌木或小乔木，具有较高的观赏价值，广泛应用于园林种植，同时也是重要的民间药用植物资源。现代药理研究表明红花檵木根、花和叶均可药用，含有较多的鞣质、脂肪酸、还原糖、甙类、异槲皮甙、黄酮类和酚类物质，临床上广泛用于上消化道出血、肺结核出血、产后出血及各类烧、烫伤等病症。红花檵木叶片中含有丰富的不饱和脂肪酸如亚油酸、山嵛酸等，可以作为抗癌药物和天然农药原料开发[1-4]。卢成瑛等[2]研究发现红花檵木粗提物对细菌的生长有明显的抑制作用。唐华等[3]的研究表明红花檵木叶片挥发油的主要成分可用于医药卫生、香料、食品添加剂和抗菌杀虫剂等领域。唐华等[4]通过分离和鉴定红花檵木叶的脂肪酸成分，发现含有大量不饱和脂肪酸，可作为中药材原料。

然而，依靠土壤种植的植株获得富含黄酮的植物提取物往往会受到很多环境因素以及病虫害的影响，培养周期长，人工消耗大，而且通过种植次生代谢产物积累往往与生长环境条件需求方面存在矛盾[5]。但植物组织培养周期短、节约耕地及经济成本、周年可以规模化生产、培养条件可人为控制[6]，而且相关学者发现通过组织培养多数植物次生代谢产物的含量高于或接近原生植物[7-9]，如檵木[Loropetalumchinense(R.Br.)Oliv.]、白英(Solanumlyratum)和人参(Panaxginseng)等次生代谢产物含量均高于原生植物,因此，利用组织培养技术生产次生代谢产物已成为生物制药的趋势[10]。在组培的环境条件中，光是非常重要的因子之一，光对植物的生长、光合作用、形态、次生代谢产物的合成和积累、基因表达都具重要的调控作用[11]。如王宇等[12]的研究表明UV-A可以显著诱导成熟津田芜菁(Brassicarapa‘Tsuda’)膨大肉质根表皮花青素的大量积累。居鑫等[13]的研究结果显示UV-A显著提高了小豆芽菜(VignaangularisL.)类黄酮和总酚的含量。目前，关于红花檵木植物组织培养技术较成熟，但对光质影响其愈伤组织黄酮类物质含量的研究还鲜见报道。

本试验以红花檵木叶片诱导的愈伤组织为试验材料，通过测定不同光质处理下愈伤组织的鲜重、干重、可溶性糖、丙二醛(MDA)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性、花色素苷含量和总黄酮含量的变化，分析其对不同光质的响应机制，探究其次生代谢产物黄酮类物质合成和累积的适宜光质条件，以期为人为调控红花檵木细胞次生代谢产物产量和品质提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

以湖南农业大学园林花卉教学基地红花檵木资源圃的 ‘花叶檵木1号’(编号为H1)、‘湘农粉娇’(编号为H2)为植物材料，以MS为基本培养基，培养基附加1.0 mg·L-1NAA和0.5 mg·L-16-BA，将所诱导的叶片愈伤组织接种于MS+2.0 mg·L-1NAA培养基中进行继代，置于不同光质条件下培养。

1.2 光源参数与处理方法

试验在湖南农业大学观赏植物教学基地的组织培养室进行，以黑暗为对照组(CK)，采用LED调制不同光质对愈伤组织进行光照培养。具体光质条件参数见表1。所用LED均统一规格，处理组之间用黑色塑料膜隔开，避免光质干扰。培养温度为(25±0.5)℃，光照时间16 h·d-1。将愈伤组织随机分为7组，每组30瓶，每瓶处理2 g，培养第15天和第30天时，测定愈伤组织的生长指标、生理指标和次生代谢物含量，每个指标3个重复。

表1 试验光源控制系统

1.3 测定指标及方法

分别取不同光质处理15天和30 d后的愈伤组织，称取其鲜重；将愈伤组织在60 ℃烘箱中烘干至恒重，称取其干重；愈伤组织PAL活性、丙二醛和可溶性糖含量采用南京建成生物工程研究所定量试剂盒测定；花色素苷含量采用pH示差法[14]。

总黄酮含量参考文献[15]方法，并稍作改动，具体为：将愈伤组织烘干后，研磨成细粉，称取干粉0.2 g，加60% 乙醇，料液比为1∶100，在100 W，60 ℃超声提取40 min后，于12 000 r·min-1冷冻离心机中离心2次，每次10 min。取1 mL上清液，加入5% NaNO2溶液4 mL静置6 min后，加入10% Al(NO3)3溶液4 mL静置6 min，再加入4% NaOH 4 mL，最后用60%乙醇将溶液定容10 mL，静置15 min后待测。以60%乙醇为空白，在510 nm波长处测量吸光度。

1.4 数据分析

用Excel 2010整理数据；用OriginPro 2018作图；用SPSS Statistics 19.0对数据进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同光质对愈伤组织生长的影响

不同光质处理显著影响红花檵木愈伤组织的鲜重和干重(表2)。在鲜重上，处理第15天，W处理H1的愈伤组织的鲜重最高，比0 d时增加了14.5%；UV-A处理H2的鲜重最高，比0 d时增加了44%。30 d时，R处理H1和H2的鲜重增加显著，对比0 d时分别增加了43.0%和76.0%；在干重上，15 d时，R处理H1的愈伤组织的干重最高，为0.14 g，比0 d时增加了55.6%；UV-A处理H2的干重最高，比0 d时增加了100%；第30天时，B+UV-A处理H1的干重比0 d时增加了100%，而各处理H2的干重增加不明显，UV-A、BP和B+UV-A处理还略有下降趋势。

表2 不同光质对愈伤组织生长的影响

总体而言，相对其他几种光质，R更有利于愈伤组织鲜重的增加，B+UV-A和UV-A更有利于干重的增加；另外，在愈伤组织干重方面光质的影响还存在一定的基因型差异，其中H1的干重在R、BP和B+UV-A处理下显著提高(P<0.05)，但H2的干重增加不显著，在处理30 d时还稍有下降趋势。

2.2 不同光质对愈伤组织生理生化指标的影响

2.2.1 可溶性糖含量由表3可知，处理第15天，R处理的H1和H2的可溶性糖含量最高，分别为31.06和25.85 mg·g-1，比CK分别高30.17%和34.22%，其次是B和W，显著高于其他处理组(P<0.05)；处理第30天时，R处理的H1和H2的可溶性糖含量分别高达36.69和34.75 mg·g-1，比0 d时分别增加了53.77%和50.17%，其次是B和W；CK、BP、B+UV-A和 UV-A 处理的H1和H2可溶性糖含量变化存在一定的基因型差异，H1都呈下降趋势，其中B+UV-A处理第30天与0 d相比下降了15.75%，而H2的可溶性糖含量除了CK下降之外，BP、B+UV-A和 UV-A处理都略有增加。

表3 不同光质对愈伤组织可溶性糖含量的影响

2.2.2 MDA含量由表4可知，处理第15天时，B+UV-A处理的H1的MDA含量为4.82 nmol·mg-1，BP处理的H2的MDA含量为6.14 nmol·mg-1，显著高于其他处理组(P<0.05)，R处理H1和H2的MDA含量都为最低，分别是2.11和2.37 nmol·mg-1；处理第30天时，置于B+UV-A光下的H1和H2愈伤组织的MDA含量达到最高，分别为5.23和7.69 nmol·mg-1，比0 d分别增加了95.88%和196.91%，显著高于其他处理组(P<0.05)。

表4 不同光质对愈伤组织MDA含量的影响

总体而言，短波长光质处理显著提高了红花檵木愈伤组织中的MDA含量，其中B+UV-A处理的增值最高；两个试验材料相比，B+UV-A处理第30天时，H2的MDA含量比H1高了47.04%，可能是H2比H1的抗氧化特性要弱，以致B+UV-A对H2的膜质伤害程度更重。

2.2.3 PAL活性由表5可知，处理15 d时，除R外，其他处理组处理的H1的愈伤组织PAL活性均比CK高，其中BP最高，为19.41 U·g-1鲜重，其次是B+UV-A，为18.30 U·g-1鲜重，显著高于其他处理组(P<0.05)；UV-A处理的H2的愈伤组织PAL活性最高，为27.06 U·g-1鲜重，其次是BP，而R最低。

表5 不同光质对愈伤组织 PAL活性的影响

处理第30天时，BP和B+UV-A处理的H1和H2的PAL活性显著高于其他处理组(P<0.05)，B+UV-A处理的H1的PAL活性最高，比0 d时增加了58.49%；BP处理的H2的PAL活性高达53.57 U·g-1鲜重，比0 d时增加了44.7%，而R处理H1和H2的PAL活性都为最低，分别是14.34 U·g-1鲜重和11.52 U·g-1鲜重。BP和B+UV-A处理的H2的PAL活性比H1分别高52.23%和42.28%。总体而言，短波长光质处理更有利于提高红花檵木愈伤组织的PAL活性，其中BP和B+UV-A处理的增效最为显著。

2.3 不同光质对愈伤组织黄酮类物质含量的影响

2.3.1 花色素苷含量如图1所示，除R处理，其余处理从0 d到30 d H1和H2的花色素苷含量逐渐增加。处理15 d时，B处理的H1的花色素苷含量最高，比0 d时增加了18.27%，而R降低了2.4%，其他处理组之间不显著(P>0.05)；BP处理的H2的花色素苷含量比0 d时增加了19.46%，而R降低了14.48%。

处理第30天时，BP处理的H1的花色素苷含量最高，为3.15 μmol·g-1，比处理前增加了51.44%，B、B+UV-A和UV-A分别增加了42.79%、33.65%和23.56%，而CK和W之间不显著(P>0.05)。BP和B+UV-A处理的H2的花色素苷含量显著高于其他处理组(P<0.05)，分别增加了72.85%和68.33%，最低的是R，仅有1.57 μmol·g-1，比0 d时降低了28.5%。

短波长的光质(B、BP、B+UV-A和UV-A)可促进H1和H2的花色素苷合成，BP处理效果最为显著，与蓝紫光可以诱导CHS、F3H和DFR的表达有关[16]，BP处理30 d后，H2的花色素苷含量比H1高21.59%，可能是因为H2的与花色素苷的合成有关的PAL活性高于H1。

2.3.2 总黄酮含量由图2可知，不同光质处理第15天，置于B+UV-A光下的H1的愈伤组织总黄酮含量最大，为125.91 mg·g-1，比0 d时增加了19.97%，而置于R、B和BP光下的愈伤组织总黄酮含量分别降低了13.52%、6.68%和6.23%；H2的愈伤组织总黄酮含量变化则与H1的有一定差异，它是在B处理下的含量最高，为192.79 mg·g-1，比处理前增加了37.17%；处理第30天，除置于R光下的H1和H2的愈伤组织总黄酮含量最低，分别比处理前降低了37.28%和7.14%之外，其他处理的含量均有增加。

总体而言，R光处理不利于红花檵木愈伤组织黄酮类物质的积累，短波长光质B+UV-A和B处理更有利于总黄酮含量的增加，其中H1的含量在B+UV-A处理下增加效果最为显著，H2的含量则在B处理下增加效果更为显著。

3 讨 论

适宜的光质在愈伤组织增殖过程中，能降低黄酮生产过程中的能耗，提高生产效益。植物愈伤组织经过继代培养可获取大量愈伤组织材料用于黄酮类物质的生产，目前关于不同光质对红花檵木黄酮含量的影响研究较少。相关学者对小麦(TriticumaestivumL.)[17]、非洲菊(GerberajamesoniiBolus)[18]和烟草(NicotianatabacumL.)[19]的研究结果表明，红光或者红光比例较高的光质处理更有助于植物的生长。本试验研究发现，R处理后的红花檵木生长状态最佳。在处理过程中，单蓝光处理不利于愈伤组织的生长，而在蓝光与其他光质组合的复合光质(BP和B+UV-A)处理下，有利于愈伤组织的生长，与前人研究结果一致。

糖类是植物体内重要的组成成分，可溶性糖含量作为中间产物能反映生长过程中代谢的快慢[20]。多数研究发现在红光或红光比例较高的光质处理下，植物体内可溶性糖含量较高。但是光质对植物可溶性糖积累的影响也因植物种类不同而存在差异。例如，白菜叶片中可溶性糖含量在红光的照射下最高[21]。在白光处理下的香椿芽苗菜的可溶性糖含量最高[22]，在白光和红蓝光比例相同的光质处理下，更有利于樱桃萝卜成熟肉质根中可溶性糖含量的积累[23]。本试验结果表明，W和R处理均能促进红花檵木愈伤组织可溶性糖的合成。同时，R处理的愈伤组织鲜重和干重均最高，可能是R处理愈伤组织合成和累积的产物高于其他6组，从而促进了愈伤组织的生长。

MDA含量常常反映植物体内脂质过氧化的程度，可间接地反映出细胞损伤的程度。当植物处于逆境环境中，MDA含量越高，表明细胞膜受损的程度越大[24]。本试验中，R处理愈伤组织MDA含量较CK显著降低，原因可能是植物体内CAT活性提高从而增强自身活性氧解毒能力的效果，导致MDA含量降低，减轻了细胞膜受伤害的程度，这也是R处理促进愈伤组织生长的原因之一。据报道，红光处理下烟草[19]MDA含量最低，蓝光处理增加了非洲菊[25]中膜质伤害程度，表明当植株受到严重的逆境伤害时，会影响植株的生长。本研究中，短波长光质处理不同程度地增加了MDA含量，与前人研究结果相似。

PAL是苯丙烷类代谢和酚类化合物合成途径中的关键酶，与植物体内一些重要的次生代谢产物合成密切相关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。当植物处于逆境环境中，植物通过增强与次生代谢产物合成相关酶的基因表达，来保护自身免受损伤。本试验结果表明，BP、B+UV-A和UV-A处理下，愈伤组织中PAL活性高于对照和其他处理组。鲁燕舞等[26]研究发现，相比于黑暗条件，蓝光处理更能提高萝卜中PAL的活性。有关光质对次生代谢产物合成过程中其他关键酶的影响，还需进一步研究。

蓝光和紫外光是促进植物花色素苷合成最有效的光质，紫外线辐射激活植物内的抗氧化酶，引起氧化反应，同时合成谷胱甘肽、抗坏血酸和酚类等抗氧化物质[27]。不同光质处理后的植物生产次生代谢物质来应对环境的改变，这可能是植物的一种自我防御机制。多数研究表明蓝光或蓝光比例较高的光质处理有利于植物花色素苷的合成。如蓝光处理更有利于番茄幼苗中花色素苷的合成[28]，在培养红叶白菜时，增加蓝光能促进其花色素苷的合成[29]；蓝光处理的马铃薯花色素苷含量较高[30]。蓝光和紫外光诱导拟南芥(Arabidopsisthaliana)[31]花色素苷的合成。同时，红光对植物合成花色素苷起到抑制作用，如红光处理后菊花(Chrysanthemum)舌状花颜色变浅，与花色素苷合成相关的基因表达量明显下降[32]；单一光照或红光比例较高时，紫叶甘薯(Ipomoeabatatas)[33]中花色素苷含量较低。但也有研究发现红光能促进植物合成花色素苷[34-35]。说明光质对植物合成花色素苷的影响与植物种类或基因型有关。本试验中，短波光质B、BP、B+UV-A和UV-A处理可促进红花檵木愈伤组织花色素苷合成，而红光(R)处理使花青素苷总含量有所下降，BP处理30 d后，H2的花色素苷含量就比H1高21.59%。

不同的光质对黄酮类化合物的合成也有较大的影响。相关学者对萝卜芽苗菜[26]、青钱柳叶(Cyclocaryapaliurus)[36]和大豆芽苗(Glycinemax)[37]的研究表明蓝光和紫外光处理后黄酮类化合物含量显著提高；也有研究发现，红光有助于三叶崖爬藤(Tetrastigmahemsleyanum)合成黄酮类成分[38]。在本试验中，红光(R)处理不利于黄酮类物质的积累，短波B+UV-A和B处理更有利于总黄酮含量的增加，且存在一定的基因型差异，研究结果与前人不完全一致，具体机制有待进一步研究。

4 结 论

R更有利于红花檵木愈伤组织鲜重的增加，但不利于其黄酮类物质的积累；B+UV-A和UV-A有利于干重、PAL活性的增加，其中B+UV-A处理效果比较显著；短波光质B、BP、B+UV-A和UV-A处理可促进红花檵木愈伤组织花色素苷合成，B+UV-A和B处理更有利于总黄酮含量的增加；在愈伤组织干重、花色素苷与总黄酮含量方面光质的影响存在一定的基因型差异。