福建云霄地方茶树品种资源生化成分特征分析与评价

陈潇敏，赵 峰，金 珊，吴文晞，王鹏杰，叶乃兴*

(1 福建农林大学 园艺学院/茶学福建省高校重点实验室，福州 350002；2 福建中医药大学 药学院，福州 350122；3 福建恒正检测技术有限公司，福州 350100)

茶树[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]种质资源是茶树品种选育和茶树生物学基础研究的原始材料，也是茶树种质创新、生产利用的物质基础[1]，儿茶素、生物碱、茶氨酸等成分优异茶树资源的挖掘、筛选是茶树育种的重要目标[2]。云霄位于福建东南部，属亚热带海洋性季风气候，地形多丘陵、低山，地貌多花岗岩露岩，具有悠久的茶叶种植和制作历史[3]，该地区野生茶树资源丰富，主要分布于云霄县火田镇白石村大帽山、小帽山、小尖山及周边山地，总面积在100 hm2以上[4-6]。特别是近年在该地区发现了野生秃房茶树群体种，相关的形态学调查也表明，该地区野生茶树体高大，叶色、叶片大小、花果等性状各异，且茶树分布规律，属有性系群体[7-8]。

儿茶素、嘌呤生物碱、氨基酸组分是茶树品种鲜叶中的最主要的生化成分，其组分构成及含量决定了茶叶品质的优劣以及适制性，从而决定了茶树资源的开发利用价值，儿茶素、生物碱、茶氨酸等生化成分特异茶树品种是今后茶树育种的主要目标之一[9]。近年来在茶树生化成分特异资源的筛选、评价鉴定已取得显著进展[10-11]，但是高含量的表没食子儿茶素-3-O-甲基-没食子酸酯(EGCG3″Me)、苦茶碱等特异茶树种质资源尚待进一步挖掘。本课题组对采集自福建省云霄县地方茶树资源聚集度较高的南乌山、梁山和小帽山，3个区域内共23份云霄县地方茶树资源的儿茶素、嘌呤生物碱和氨基酸组分进行了分析，旨在挖掘出优特异茶树种质资源，为茶树品种创新和特异资源的创新利用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料于2021年3月采集福建省云霄县23份茶树品种资源的一芽二叶鲜叶,参试茶样信息见表1。采用液氮固样，以干冰保存并转运至福建农林大学茶学福建省高校重点实验室，冷冻干燥后粉碎过60目筛。

表1 23份云霄地方茶树品种资源信息

1.1.2 仪器与设备UltiMate 3000 高效液相色谱仪(美国，赛默飞世尔科技公司)，C18反相色谱柱(5 μm，4.6×250 mm)(中国，广州菲罗门公司)；NexeraX2 LC-30A高效液相色谱仪(日本，Shimadzu公司)，串联Sciex 4500 Q-Trap质谱仪(美国，Sciex公司)；C18反相色谱柱(2.6 μm，2.1×100 mm)(中国，广州菲罗门公司)；AB204-N分析天平(美国，梅特勒公司)；超纯水系统(中国，Medium Touch，上海和泰仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 儿茶素组分测定方法采用高效液相色谱法，参照王丽丽等[12]方法稍作修改，具体步骤如下：

色谱条件：流动相A为0.2%甲酸-水溶液(v∶v)，流动相B为甲醇；流速，1.00 mL/min；柱温，40 ℃；进样量，10 μL。梯度洗脱条件，0～2 min，88% A；2～10 min，88%～75% A；10～15 min，75%～73% A；15～25 min，73%～68% A；25～30 min，68% A；30～32 min, 68%～88% A。前处理方法：分别称取0.200 g样品，分别加入30 mL甲醇，涡旋，超声提取30 min，冷却后于4 ℃、10 000 r/min离心5 min，上清液过0.22 μm有机相微孔滤膜。

1.2.2 嘌呤生物碱组分测定方法参照陈潇敏等[13]，采用液质联用方法测定。

1.2.3 氨基酸组分测定方法按照Zhou等[14]，采用AQC衍生液质联用法测定。

1.3 标准品与试剂

9种儿茶素标品：表没食子儿茶素-3-O-(3-O-甲基)没食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-O-(3-O-methylgallate)，EGCG3″Me]、儿茶素(catechin, C)、表儿茶素(epicatechin, EC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallicacid, EGCG)、表没食子儿茶素(epigallocatechin, EGC)、没食子儿茶素(gallocatechin, GC)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate, ECG)、没食子儿茶素没食子酸酯(gallocatechin gallate, GCG)、儿茶素没食子酸酯(catechin gallate, CG)；4种嘌呤生物碱标品：咖啡碱(caffeine, CAF)、可可碱(theobromine, TB)、苦茶碱(theacrine, TC)、茶碱(theophylline, TP)；33种氨基酸标品：丙氨酸(alanine, Ala)、α-氨基丁酸(α-aminobutyric acid, α-ABA)、β-氨基丁酸(β-aminobutyric acid, β-ABA)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)、精氨酸(arginine, Arg)、天冬氨酸(aspartic acid, Asp)、瓜氨酸(citrulline, Cit)、羟脯氨酸(hydroxyproline, Hy-pro)、胱氨酸[cystine,(Cys)2]、组氨酸(histidine, His)、同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)、羟赖氨酸(hydroxylysine, Hy-Lys)、异亮氨酸(isoleucine, Ile)、亮氨酸(leucine, Leu)、赖氨酸(lysine Lys)、蛋氨酸(methionine, Met)、1-甲基-L-组氨酸(1-methyl-L-histidine, 1-M-His)、3-甲基-L-组氨酸(3-methyl-L-histidine, 3-M-His)、鸟氨酸(ornithine, Orn)、苯丙氨酸(phenylalanine, Phe)、脯氨酸(proline, Pro)、肌氨酸(sarcosine, Sar)、丝氨酸(serine, Ser)、苏氨酸(threonine, Thr)、色氨酸(tryptophan, Trp)、酪氨酸(tyrosine, Tyr)、缬氨酸(valine, Val)、天冬酰胺(asparagine, Asp)、半胱氨酸(L-cysteine, Cys)、茶氨酸(theanine, Thea)、谷氨酰胺(glutamine, Gln)、谷氨酸(glutamic acid, Glu)、甘氨酸(glycine, Gly)，均购于源叶生物科技有限公司(中国，上海)，纯度均大于98%。色谱纯甲醇(中国，安谱实验科技股份有限公司)；色谱纯乙腈(中国，上海默克化工技术有限公司)，色谱纯甲酸(中国，国药集团化学试剂有限公司)。甲酸铵(中国，安谱实验科技股份有限公司)。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 云霄地方茶树品种资源儿茶素组分分析

本研究测定了9种主要儿茶素，即EGC、C、EGCG、EC、EGCG3″Me、ECG、GC、GCG和CG，其中GC、GCG和CG在23份资源中均未检测(图1)；其余的6种儿茶素组分在23份茶树种质中的平均含量分别为16.00、1.86、104.55、4.64、14.23和19.17 mg·g-1(表2)。23份茶树品种资源中，儿茶素总量在73.54～260.31 mg·g-1，其中，EGCG的含量最高，EC和C在不同品种资源中含量均较低。另外，在23份云霄地方茶树品种资源中均检测到EGCG3″Me，其最大值为33.65 mg·g-1，均值大于10 mg·g-1，说明云霄地方茶树群体蕴含丰富的EGCG3″Me资源。由表2还可知，23份茶树品种资源中，儿茶素各组分含量及总量等7个指标的变异系数在31.46%～109.75%，变异范围较大，其中C含量的变异系数最大。遗传多样性指数(H′)在1.27～1.99，其中EGC、EC的遗传多样性指数较高。

表2 23份云霄地方茶树品种资源儿茶素含量的分布特征和变异情况

23份云霄地方茶树品种资源的儿茶素指数(CI)如图2所示。前人研究报道福建地区的儿茶素指数较低，而云南地区的儿茶素指数较高，可能是因为福建茶树资源EGCG含量较高，从而导致CI值低。从图中可以看出，该地区的茶树资源CI值均低于0.5，最高为L02(0.26)，这一结果与前人研究相一致。

2.2 云霄地方茶树品种资源嘌呤生物碱组分分析

在23份茶树品种资源中，均未检测出茶碱，部分茶树品种资源中含有可可碱和苦茶碱(图3)。咖啡碱、苦茶碱、可可碱及嘌呤生物碱总量的分布范围分别在14.59～46.45、0.00～33.50、0.00～1.69和15.28～70.42 mg·g-1，平均含量分别为32.58、7.63、0.73和40.95 mg·g-1(表3)。咖啡碱和嘌呤生物碱总量的变异系数均小于30%，而苦茶碱的变异系数最大，为161.16%。各组分的遗传多样性指数(H′)为1.15～2.07，其中可可碱和总量均大于2.00，说明其具有较高的多样性。

表3 23份云霄地方茶树品种资源嘌呤生物碱含量的分布特征和变异情况

在栽培茶树品种中，嘌呤生物碱的分布模式主要是以咖啡碱为主，含有少量的可可碱和微量的茶碱。苦茶碱仅在部分苦茶中含有。本研究的23份云霄地方茶树品种资源中，南乌山及小帽山地区仅有4份资源检出苦茶碱，且含量均低于10 mg·g-1(X01除外)，而在梁山地区的茶树品种资源(L01～L06)均检测出苦茶碱，且含量均高于10 mg·g-1(L05除外)。L06和L07的苦茶碱含量高于其咖啡碱含量，其嘌呤生物碱模式异于普通茶树，可作为苦茶碱形成机理研究及特异资源育种材料(图4)。

2.3 云霄地方茶树品种资源游离氨基酸构成分析

茶氨酸(Thea)是茶树鲜叶中的主要氨基酸，其与谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)均为鲜味氨基酸。在23份茶树种质中，这3种物质的平均值分别为12.74、1.55和0.66 mg·g-1，变异系数均大于66%。丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)和苏氨酸(Thr)为甜味氨基酸，在23份茶树品种资源中平均值分别为0.45、0.20和0.35 mg·g-1。苦味氨基酸如酪氨酸(Tyr)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)和异亮氨酸(Ile)含量较高，除了异亮氨酸(Ile)，其余3个组分含量平均值均超过了0.3 mg·g-1。不同氨基酸组分变异系数差异较大，其中天冬酰胺(Asn)、甘氨酸(Gly)、β-氨基丁酸(β-ABA)、谷氨酰胺(Gln)和精氨酸(Arg)的变异系数均超过了100%。可见，云霄地方茶树品种资源的氨基酸组分存在丰富变异(表4)。

表4 23份云霄地方茶树品种资源氨基酸含量的分布特征和变异情况

2.4 不同区域云霄地方茶树品种资源滋味物质成分分析

为探究云霄不同区域茶树品种资源之间的差异物质，我们以6种儿茶素组分、3种嘌呤生物碱及20种氨基酸为指标，进行单因素方差分析，筛选获得影响不同区域云霄地方茶树品种资源滋味物质的差异物质。结果如图5所示，29种物质在3个类群中有16种物质含量存在极显著差异，如EGC、EC、EGCG3″Me、苦茶碱(TC)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)，而EGCG、咖啡碱(CAF)、茶氨酸(Thea)等13种物质含量在3个类群中无显著差异。以各类群的EGCG3″Me、苦茶碱(TC)、酪氨酸(Tyr)及丙氨酸(Ala)含量数据绘制箱型图(图6)可知，小帽山茶树资源的EGCG3″Me及酪氨酸(Tyr)含量极显著高于其他2个类群，而梁山茶树资源的苦茶碱(TC)及缬氨酸(Val)含量极显著高于其他2个类群，南乌山茶树资源的4种物质含量均为最低。

偏最小二乘法判别分析(PLS-DA,partial least squares discriminant analysis)是一种常用来处理分类和判别问题的方法，能够较为直观地区分组间差异。对不同生长区域云霄地方茶树品种资源的主要滋味成分进行sPLS-DA分析，以贡献率最高的两个主成分为横纵坐标轴绘制各类群的得分图(图7)。从图中可以看出，云霄不同区域的茶树品种资源在滋味成分上具有较大差异。梁山和小帽山地区的茶树资源没有完全分开，而南乌山地区的茶树资源与其他两个区域完全分开。该结果说明，梁山和小帽山地区的茶树资源品质构成较为相近，而南乌山地区与前二者间存在较为明显的差异。

以23份云霄地方茶树品种资源的29种物质含量绘制聚类热图(图8)，从图中可以看出不同区域的云霄地方茶树品种资源在生化成分上都具有各自的特点。如图中区域1为南乌山茶树资源高含量的生化成分，主要是氨基酸组分，如丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)。区域2展示了梁山较高含量的组分，如天冬酰胺(Asn)、赖氨酸(Lys)等氨基酸组分，除此之外，梁山茶树资源还具有高含量的苦茶碱(TC)。区域3为小帽山茶树资源的高含量组分，主要是儿茶素组分，如EGC、EGCG、EGCG3″Me、ECG等，除此之外，咖啡碱(CAF)在该类群也具有较高的含量。

2.5 云霄地方茶树优异资源的筛选

根据生化成分测定结果，参照王新超等[16]的茶树优异资源筛选指标，从23份云霄地方茶树品种资源中筛选出一批生化成分特异的品种资源(表5)，包括5份高儿茶素茶树资源，2份高EGCG茶树资源、6份高EGCG3″Me茶树资源、2份高嘌呤生物碱茶树资源、2份高苦茶碱资源和1份高茶氨酸茶树资源。

表5 云霄地方茶树优异资源的筛选

3 讨 论

3.1 云霄地方茶树品种资源总体生化成分特征

云霄地方茶树品种资源中儿茶素组分均以EGCG、ECG和EGC为高含量组分,其中EGCG含量最高，这与前人的研究结果一致[12,16]。研究表明，中国茶树种质具有丰富的多样性，但中国茶树种质的整体儿茶素指数(CI)较低，除云南茶树资源的CI大于0.5，其他地区的茶树种质资源的CI值均不足0.5[17]。本研究结果显示，云霄地方茶树品种资源的CI值也较低，最大值仅为0.26。EGCG3″Me(表没食子儿茶素-3-O-甲基-没食子酸酯)是茶叶中一种天然被修饰的儿茶素物质，相较于EGCG,它的抗过敏和消炎等药理作用更强，尤其是花粉过敏反应的抑制效果极佳[18-20],但是目前中国发现天然含有EGCG3″Me的茶树并不多[21-23]，而在云霄地方茶树群体中均检测到了EGCG3″Me，且部分资源含量较高，如小帽山3号(X03)含量高达33.65 mg·g-1。这也为茶树中甲基化儿茶素的积累及分子研究提供了试验材料。

云霄地方茶树品种资源中嘌呤生物碱组分含量及构成与普通茶树相一致，以咖啡碱为主要嘌呤生物碱，含有少量的可可碱，均未检测到茶碱。而在部分资源中检测到了苦茶碱，其中梁山1号(L01)和梁山6号(L06)苦茶碱含量大于30 mg·g-1。迄今为止，含有苦茶碱的野生茶树资源研究集中于福建、广东、贵州、云南、江西等地区[23-28]，福建高苦茶碱茶树种质资源丰富，‘梁山1号’和‘梁山6号’的发现，可为高苦茶碱茶树品种培育及开发利用提供茶树资源材料。

云霄地方茶树品种资源中氨基酸组分种类丰富，不同滋味的氨基酸种类均有检出。氨基酸组分是茶叶滋味和香气形成的重要前体物质，其组分的多样性为云霄高香优质茶叶产品的加工制作奠定了物质基础。该群体中的梁山6号(L06)属于高茶氨酸特异资源。

3.2 不同区域的云霄地方茶树种质资源生化成分特点

魏沙沙等[29]对自然分布的尤溪4个区域(赤墓村、光明村、丘山村、赤墓村非保护区)37份苦茶单株进行主要滋味物质检测，结果表明4个区域均有各自特征，其中赤墓村苦茶苦味程度较高，酯型儿茶素以及可可碱含量较高；光明村苦茶苦味最低，丘山村苦茶的赖氨酸等含量较高，赤墓村非保护区群体的鲜味氨基酸如天冬氨酸含量更高。本研究发现云霄南乌山、梁山、小帽山3个区域的茶树资源也具有明显的区域特点。梁山茶树资源均含有苦茶碱(TC)，且部分茶树资源含量较高，如‘梁山1号’(L01)和‘梁山6号’(L06)，苦茶碱含量均超过30 mg·g-1。小帽山茶树资源儿茶素组分较为特异，ECGC和EGCG3″Me含量较高。高EGCG3″Me含量的茶树种质资源的分布具有一定的区域性特征。研究发现广东和福建两省含有EGCG3″Me的茶树种质资源较多，高于云南等地[30]。南乌山茶树资源表现为某些氨基酸组分如丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)含量较高。区域特色的形成与区域间的地理位置、环境差异密切相关，具体形成机理仍需进一步研究。茶树资源的区域特色性为当地茶叶资源利用及加工提供了一定的理论基础。

致谢：本研究实验样品采集承蒙云霄县茶叶科学研究会王彩云、方德音、蔡捷英、王金焕等各位老师，漳州仙隐峰茶叶有限公司张木山董事长、福建省顾恒生态农业发展有限公司张英豪董事长的大力支持，特此致谢！