胶体金免疫层析法在碳青霉烯酶快速分型中的临床应用

萨磊，马立艳

近年来，随着人口老龄化、抗菌药物的广泛使用、侵入性操作技术的发展等，多重耐药细菌的检出率呈明显上升趋势[1]。碳青霉烯类抗菌药物是治疗多重耐药肠杆菌目细菌的主要药物，但是在抗生素选择压力下，2019年全国三级医院耐碳青霉烯肠杆菌目细菌（carbapenem-resistantEnterobacterales，CRE）的分离率已达到 10% ～ 30%，使临床治疗选药困难重重，患者死亡率明显上升[2]。产生 A 类丝氨酸酶（KPC）、B 类金属酶（VIM、IMP、NDM）或D 类 OXA-48 型碳青霉烯酶是肠杆菌目细菌对碳青霉烯类药物最常见的耐药机制，而酶型的不同直接影响临床的抗感染用药、患者的疗效和预后[3]。根据 CLSI M100 S30 文件，临床实验室检测碳青霉烯酶酶型主要采用改良碳青霉烯酶灭活试验（mCIM）和 EDTA 介导的碳青霉烯酶灭活试验（eCIM）联合检测方法，但该方法需要对分纯菌株过夜孵育，仅可区分 A 类丝氨酸酶和 B 类金属酶。实验室条件允许时，也可采用分子生物学方法，但 PCR 检测需要配备专门的实验仪器，工作人员需要获得检测资质，单个检测成本较高，并未在临床实验室得到常规开展。因此，在临床治疗选药和感控工作的迫切需求下，可同时快速进行碳青霉烯酶（KPC、OXA-48、VIM、IMP、NDM）分型的胶体金免疫层析法得以研发[4]。

本研究选取对碳青霉烯类药物耐药（CRE）和敏感的肠杆菌目细菌（carbapenem-susceptibleEnterobacterales，CSE），以 PCR 耐药基因分型和测序为金标准，采用胶体金免疫层析法检测碳青霉烯酶酶型，评估其在临床中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集 2020年 3月 - 9月首都医科大学附属北京友谊医院微生物室分离保存的对亚胺培南、厄他培南或美罗培南耐药的肠杆菌目细菌，仅保留同一患者同一部位分离的第一株细菌。A 类丝氨酸酶阳性对照菌株为肺炎克雷伯菌 ATCC BAA-1705，B 类金属酶阳性对照菌株和D 类 OXA-48 型阳性对照菌株为本室保存菌株，经测序证实。阴性对照菌株为大肠埃希菌 ATCC25922 和 30 株碳青霉烯类敏感肠杆菌目细菌。

1.1.2 主要仪器和试剂 VITEK-MS 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪、基质液 CHCA、VITEK 2- Compact全自动微生物分析系统、VITEK 2 药敏卡均为法国生物梅里埃公司产品；哥伦比亚血琼脂培养基和 MH 琼脂培养基购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司；亚胺培南、美罗培南和厄他培南 E-test 条购自安图生物工程股份有限公司；碳青霉烯酶检测试剂盒和胶体金免疫层析法购自长沙中生众捷生物技术有限公司；DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；PCR Master Mix 试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；ABI7500 PCR 仪购自美国应用生物公司。

1.1.3 碳青霉烯酶基因引物序列[5]包括 A 类丝氨酸酶KPC，B 类金属酶 NDM、VIM 和 IMP，D 类酶 OXA-48，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具体引物序列见表1。

表1 碳青霉烯酶基因引物序列及片段长度

1.2 方法

1.2.1 菌种复苏确认 将冻存的菌株进行复苏，35 ℃ 孵育得到单个纯菌落，MALDI-TOF MS 鉴定确认。应用VITEK 2- Compact 全自动微生物分析系统、MH 琼脂培养基和亚胺培南、美罗培南和厄他培南 E-test 条对 CRE 和CSE 菌株进行确认。

1.2.2 胶体金免疫层析法检测酶型 于试剂盒提供的 EP管中加入 5 滴约 150 μl 提取缓冲液，使用 1 μl 接种环取一环样本置于缓冲液中涡旋振荡混匀 5 ～ 8 s，使用一次性移液管吸取混合液于试剂卡上“S”孔位滴入 5 滴（约100 μl），15 min 读取结果。

1.2.3 PCR 方法检测酶型 采用 PCR 方法检测酶型作为金标准。使用 TIANamp Bacteria DNA Kit 提取菌株基因组 DNA，反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，30 个循环；72 ℃ 5 min。阳性产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序确认。

1.2.4 数据分析 以 PCR 方法酶型检测结果为对照，比较胶体金免疫层析法检测酶型结果的敏感性和特异性。

2 结果

共收集到 81 株肠杆菌目细菌，包括 51 株 CRE 和30 株 CSE。51 株 CRE 菌株中 39 株为产碳青霉烯酶肠杆菌目细菌（carbapenemase-producingEnterobacterales，CPE），包括大肠埃希菌 7 株，肺炎克雷伯菌 31 株，阴沟肠杆菌 1 株。30 株 CSE 菌株中包括大肠埃希菌 9 株，肺炎克雷伯菌 17 株，阴沟肠杆菌 2 株，产酸克雷伯菌2 株。对 39 株 CPE 采用胶体金免疫层析法进行酶型检测，产 KPC 酶 30 株，产 NDM 酶 5 株，产 VIM 酶1 株，产 OXA-48 酶 2 株，1 株菌在检测卡上同时出现两条阳性条带，显示同时检测到 KPC 酶和 NDM 酶（图1）。39 株 CPE 菌株 PCR 方法检测酶型结果，产 KPC-2型酶30 株，产 NDM-1 酶 5 株，产 VIM 酶 1 株，产 OXA-48酶 2 株，1 株菌同时产 KPC-2 和 NDM-1 酶（图2）。两种方法均未检测到 IMP 酶型。所有的 30 株 CSE 菌株在胶体金免疫层析法和 PCR 方法检测中酶型均为阴性（表2）。与 PCR 检测结果相比，胶体金免疫层析法实验结果的敏感性 100%，特异性 100%。

表2 胶体金免疫层析法和 PCR 快速检测碳青霉烯酶结果

图1 胶体金免疫层析法检测结果

图2 碳青霉烯酶基因 PCR 检测结果

3 讨论

碳青霉烯酶酶型的快速区分可帮助临床医生对抗生素的使用作出选择，如果是产 A 型丝氨酸酶的 CPE 菌株所致感染，头孢他啶-阿维巴坦是不错的选择。如果是产 D 类金属酶的 CPE 菌株所致感染，则需要根据药敏结果使用黏菌素或联合使用氨曲南等。因此，每个患者感染 CPE 的酶型不同，治疗思路上也有很大不同。

据中国细菌耐药监测网数据，临床分离 CRE 菌株中，KPC-2 酶型的检出率为 57%（627/1105），NDM 酶型的检出率为 31%（343/1105）[5-6]。目前，碳青霉烯酶的检测方法比较有限，CLSI M100 S30 文件推荐使用的 mCIM 方法在 CPE 菌株中的检测敏感性达到 93% ～ 100%，特异性达到 97% ～ 100%[7-8]。mCIM 联合 eCIM 试验的敏感性和特异性分别为 89.3% 和 98.7%[8]。虽然检测结果能基本满足临床需求，但该方法需要在获得纯培养菌落后进行过夜孵育，当抑菌圈直径落在临界值附近时会造成结果判读困难。作为酶型检测金标准的分子生物学方法虽然可以将酶型进一步分型，但是对实验室条件和检验人员素质都有一定要求，而且检测成本高，因此在大多数医院尚未常规开展。

胶体金免疫层析检测方法是一种基于抗原、抗体免疫反应的成熟检测技术，随着高灵敏标记物的使用[9]，以及对层析膜的优化[10]，这项技术在保持原有优点的同时得到进一步优化和提升。该方法可以简单而快速地对临床常见碳青霉烯酶进行分型，不需要特殊专业的技术技能，报告时间不超过 15 min，相比 CLSI 推荐方法检测时间大大缩短。本研究中所采用的胶体金免疫层析试剂盒与 NG-Test Carba 5[11]有所不同，原料来自于法国，检测原理相同，但是在国内生产，制造成本有所降低。与 Xpert Carba-R 相比，胶体金免疫层析方法检测的是碳青霉烯酶，并非碳青霉烯酶基因，操作更为简便，检测时间更短，而且不需要购置昂贵的仪器，每个测试的检测成本也更低。本研究中，胶体金免疫层析法对 KPC、NDM、VIM、IMP 和 OXA-48 的检测敏感性和特异性都达到了 100%，完全能够满足临床治疗选药需求。不足之处就是对于少见酶型，如 GES、IMI 和 GIM 尚不能进行检测。

综上，胶体金免疫层析法在 15 min 内即可区分 3 类5 型碳青霉烯酶，操作简单易行，有助于临床选择有效的治疗方案，降低治疗成本，提高 CRE 感染患者的生存率并改善预后，减少耐药株在医疗机构内的水平传播。