银杏叶多糖对发酵乳品质及抗氧化活性的影响

贺莹，王连

吕梁学院生命科学系（吕梁 033000）

银杏是一种水生裸子叶植物。银杏全株都是宝，根、皮、叶、果具有很高的医用药物和可食用观赏价值[1]。银杏叶的营养成分主要为VC、VE、胡萝卜素及钙、磷、硼、硒等矿物元素含量也十分丰富，超过一般水果蔬菜及可食植物原料[2]。有研究表明银杏叶多糖具有增强抗肿瘤和抗炎抑菌的医疗功效，同时它还具有自由基抵抗病毒清除作用、延缓衰老、扩张局部脑血管血液循环、促进脑部血液循环、抗氧化[3]等医疗作用。银杏叶多糖可以抑制老年人急性早幼粒白血病的异常细胞分化增殖，同时可以抑制恶性癌细胞的分化增殖[4]。试验以银杏叶多糖为主要研究对象，分析不同银杏叶多糖添加量对发酵乳的酸度、乳酸菌活菌数、持水力度、抗氧化活性等的影响，以期开发出银杏叶多糖的功能性食品，为银杏叶多糖发酵乳研发提供理论基础[5]。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

银杏叶多糖（从购于安徽合肥市的银杏叶中提取）；伊利学生营养奶粉；白砂糖（食品级，磁县田好食品有限公司）；酸奶发酵剂（北京川秀国际贸易有限公司）；正丁醇、乙醇、双氧水、硫酸亚铁（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）。

SC-04型离心机（盐城市凯特实验用仪器厂）；LDZX-50KBS高压蒸汽灭菌锅、DF-101S电热恒温培养箱、电热鼓风干燥箱（101-2A）（均为上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；HC60001电子天平（无锡玛瑞特科技实业有限公司）；PHS-3E pH计（上海精密化学仪器有限公司）；UV-3100PC紫外分光光度计（上海美普达有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 银杏叶多糖的制备

1.2.1.1 工艺银杏叶多糖的提取流程

原料采摘清洗→干燥→粉碎→过称，加水→恒温浸提→（隔夜后）过滤→离心→恒温水浴浓缩→ Sevage法除去蛋白→离心→95%乙醇沉淀→（隔夜）离心→干燥（60 ℃烘干）

1.2.1.2 操作要点

将清洗过的新鲜银杏叶风干、粉碎，用电子天平称取150 g银杏叶粉，按照料液比1∶10（g/mL）加水，样品溶液置于85 ℃恒温水浴锅中进行提取，隔夜后用8层纱布对样品进行过滤，提取后将滤液在4 000 r/min下离心20 min，重复操作2次，获取样品上清液。在80 ℃的恒温水浴锅对离心液进行浓缩。用Sevage法除去样品中的沉淀物蛋白质，离心2次；在快速获得上清液加入3倍体积的95%乙醇，隔夜在低温冷藏（4 ℃）条件下继续保存；对样品沉淀后的上清液和白色絮状多糖进行离心，进行高温水浴蒸干后，放入55 ℃干燥箱中烘干，即可快速获得白色银杏叶絮状多糖[5]。

1.2.2 银杏叶多糖发酵酸乳的制备

配制100 mL的新鲜纯牛奶，在60 ℃恒温条件下加入5 g的蔗糖搅拌溶解后，分别在牛奶中加入0，0.05%，0.10%，0.15%，0.20%和0.25%的银杏叶多糖，在100 ℃左右的条件下进行巴氏杀菌8 min左右，放置在室温的条件下进行冷却，将样品分别接种1.0%保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌复合粉。恒温培养箱设置45 ℃，样品进行低温发酵6 h。经冷却后放入冰箱的冷藏层，后熟24 h制得银杏叶多糖益生菌发酵乳[6]，以添加银杏叶多糖比例0的样品为试验对照组。

1.2.3 乳酸菌活菌数的测定

加入不同浓度的银杏叶多糖的发酵乳，进行乳酸发酵，24 h后采用平板计数法[7]测定乳酸菌的数量和菌落。

1.2.4 酸度的测定

pH测定采用精密pH计测定（pH计使用前务必进行校准，否则会影响试验的准确度）。

1.2.5 持水力的测定

称定15 mL离心管质量，记为W0；加入10 mL银杏叶多糖发酵乳，离心，此时离心管质量记为W1；经离心的样品静置10 min后弃去上清液，称其质量，记为W2。重复测定3次，最终取平均值。持水力（W）按式（1）计算。

1.2.6 羟基自由基清除率的测定

样品用95%乙醇配制成0.10 g/mL质量浓度的样品溶液，向样品中依次加入H2O2、硫酸亚铁和水杨酸，混合均匀后，在35 ℃水浴中继续加热30 min，设置在510 nm处测定样品的吸光度Ai，用蒸馏水将样品溶液清除作为空白对照，其样品所测得吸光度A0，加入H2O2代替为蒸馏水时，测得样品的吸光度Aj，分别平行操作3次[8]。羟基自由基清除率（A）按式（2）计算。

1.2.7 DPPH自由基清除率的测定

溶液中加入3 mL的DPPH-乙醇混合溶液配制质量浓度为0.1 g/mL的溶液，在30 ℃水浴加热0.5 h后，在510 nm波长测得DPPH-乙醇溶液试样吸光度（Ai），以3 mL蒸馏水代样品溶液测得空白吸光度（A0），以3 mL的95%乙醇溶液平行代替3 mL的DPPH-乙醇溶液，测得样品吸光度（Aj），每个样品平行测定3次，取其吸光度的平均值[9]。DPPH自由基清除率（A）按照式（3）计算。

1.2.8 Fe3+还原能力

样品均用95%盐酸乙醇溶液配制合成质量浓度0.10 g/mL溶液，在3 mL样品中溶液中依次加入铁氰化钾溶液（0.8 mol/L）和2倍体积的磷酸盐缓冲溶液（0.1 mol/L）各3 mL，在50 ℃条件下保温30 min后，取其混合，分别加入10%三氯乙酸溶液3 mL，以4 000 r/min混合离心15 min后取其上清液3 mL，加入3 mL蒸馏水和0.2 mL的0.1%三氯化铁溶液，常温的工作条件下反应15 min后，最终在680 nm波长的条件下测定吸光度[10-11]，重复进行测定3次。

1.3 数据处理

采用Origin绘图软件绘制银杏叶多糖对酸乳影响趋势图，采用SPSS 25.0软件进行显著性分析抗氧化活性[12]。

2 结果与分析

2.1 银杏叶多糖对发酵乳乳酸菌菌落的影响

由表1可知：随着银杏叶多糖含量增加，发酵酸乳的活菌数目呈递增的变化趋势，从1.36×108CFU/mL增加到（2.26±0.35）×108CFU/mL，说明银杏叶多糖添加量0.15%时，其益生菌乳酸菌菌落数明显高于对照组（p＜0.05），说明银杏叶多糖可以有效促进植物乳酸菌和其他代菌落的代谢和增殖。

表1 银杏叶多糖添加量对发酵乳乳酸菌菌落的影响

2.2 银杏叶多糖对发酵乳酸度的影响

由图1可知：银杏叶多糖添加量逐渐递增，发酵酸乳的酸度pH呈现下降趋势，而且不同的银杏叶多糖添加量发酵酸乳的pH都显著性低于对照组（p＜ 0.05），这与pH试纸测定的结果相对一致。发酵乳pH的降低主要因素是乳酸菌的生长，多糖类的物质在发酵过程中产生的有机酸。pH与发酵乳酸乳的风味相关，且会影响食品安全。降低发酵酸乳pH，不仅可以改善发酵酸乳的风味和组织形态，同时还可以抑制有害微生物的生长，延长酸乳的储存期。

图1 银杏叶对发酵乳酸度的影响

2.3 银杏叶多糖对发酵乳持水力的影响

由图2可知，当银杏叶多糖添加量逐渐递增，发酵酸乳的持水力呈先上升后下降的变化，不同银杏叶多糖添加量对发酵乳的持水力都有明显增强的效果，且银杏多糖添加量0.15%时，发酵乳的持水力达到最高值。发酵酸乳中有大量的酪蛋白成分，蛋白质中氨基酸分子之间可以形成致密的网状胶体结构，该结构可以容纳水及其他多种物质，因此可以提高持水性能。银杏叶多糖添加量高于0.20%后，由于过量的糖被破坏蛋白质的凝聚作用，导致乳清析出过多，引起持水力下降。

图2 银杏叶多糖对发酵乳持水力的影响

2.4 银杏叶多糖对发酵乳羟基自由基清除率的影响

由图3可知：与对照组发酵乳的羟基自由基清除率相比，随着银杏叶多糖含量增加，发酵酸乳清除羟基自由基清除率呈现逐渐升高趋势，清除率到峰值，各处理组和空白对照组之间的羟基自由基清除率具有显著性差异（p＜0.05）。说明添加一定量的银杏叶多糖可以有效提高发酵酸乳的羟基自由基清除能力。银杏叶多糖可能是一种良好的电子供体，供给羟基自由基后将其还原为OH-，从而导致羟基自由基清除。

图3 银杏叶多糖对发酵乳羟基自由基清除率的影响

2.5 银杏叶多糖对发酵乳DPPH自由基清除率的影响

由图4可得：随着银杏叶多糖添加量的增加，与对照组发酵乳的DPPH自由基清除率相比，发酵乳的DPPH自由基清除出现逐渐递增趋势，清除率最高的对照组可达75%，并且各组的清除处理明显高于其他对照组（p＜0.05）。结果表明，添加适量银杏叶多糖可有效提高发酵乳的DPPH自由基清除力。银杏叶多糖在生化反应中作为一种供氢自由基物质，与自由基离子发生反应生成稳定的自由基物质，抑制其与DPPH自由基阳离子所发生的反应。

图4 银杏叶多糖对发酵乳DPPH自由基清除率的影响

2.6 银杏叶多糖对发酵乳Fe3+还原力的影响

由图5可知：随着银杏叶多糖添加量增加，发酵乳的Fe3+的化学还原和抗氧化能力均有很大提高，而且不同银杏叶多糖添加量对发酵乳的Fe3+还原和抗氧化能力均高于空白对照组（p＜0.05）。结果表明，大部分中发酵乳的Fe3+转化为Fe2+。银杏叶多糖可使其发酵乳很好地成为一种良好的活性电子物质供体，具有很好的化学还原和抗氧化性能，除了可将样品中的大部分Fe3+转化为Fe2+，还可与自由基化学等物质直接发生抗氧化反应，从而形成稳定的物质。因此，银杏叶多糖可以大幅提高发酵乳的还原和抗氧化能力。

图5 银杏叶多糖对发酵乳Fe3+还原力的影响

2.7 最佳银杏叶多糖对酸乳抗氧化活性的影响

由SPSS 25.0软件、Origin-2019软件分析银杏叶多糖对酸乳的乳酸菌落总数、酸度、持水力度、抗氧化活性的显著性分析，可得出银杏叶多糖含量对酸乳的最佳益生效果。银杏叶多糖添加量0.15%时，其持水力和抗氧化活性达到最优。添加银杏叶多糖可以有效改善发酵酸乳的组织状态和风味，抑制有害微生物的增殖，延长发酵乳的最佳品尝期。

3 结论

以银杏叶为原料，采用银杏叶水提醇沉法、Sevage法除蛋白等方法进行提取银杏叶多糖，将银杏叶多糖添加到纯奶中进行发酵，通过显著性分析数据，得到银杏叶多糖对酸乳的影响趋势图，分析银杏叶多糖对发酵乳的最佳影响发展趋势及发酵最佳效果，从而得出银杏叶发酵多糖添加量0.15%时，其持水力和抗氧化活性达到最优。适量添加银杏叶多糖可以有效改善发酵酸乳的组织状态和风味，可为生产和食品应用提供参考。