毛白杨叶际酵母对重金属及有机污染物胁迫的耐受研究

周健，杜克久，才满

(1河北农业大学 林学院，河北 保定 071000;2河北林木种质资源与森林保护重点实验室，河北 保定 071000)

随着环境污染和生态破坏，土壤污染问题日趋严重，其中重金属污染以及有机污染物的土壤面积在不断增加，使土壤肥力退化，降低农产品品质和产量，并通过食物链危及人类的生命健康[1]。重金属镉(Cd)被广泛应用于塑料稳定剂、橡胶等产品的加工和制造，全球土壤中Cd的平均含量约为0.41 mg/ kg，在一些地区达到2.0～8.9 mg/kg[2-5]。研究表明高浓度的Cd2+处理抑制了烟草叶绿素的合成，叶绿素含量和光合强度随Cd含量的上升而逐渐下降[6]。较低浓度的Cd对人体就有显著生物毒性,过量积累会导致肾功能不全、骨质疏松和癌症等疾病[7]。铬(Cr)一般通过自然活动进入环境，大气中Cr含量很低，仅为0.4 μg/m3，淡水中Cr的浓度0.1～117 mg/L，，有研究发现土壤中高浓度的Cr可显著降低小麦和高粱的种子萌发[8]。Cr同样可通过食物链在人体内富集，引发癌症和其它疾病[9]。除重金属外，有机污染物也是备受关注的环境污染物，笨并芘被世界卫生组织认定为三大致癌物之一，在我国6大类地区土壤中均被检测出，其中东北、华北地区质量分数超过1 500 μg/kg[10-12]。有研究显示PAHs对植物的毒害效应与PAHs的浓度呈正相关[13]。多溴联苯醚(PBDEs)作为环境 持久性有机污染物也具有较高的环境本底，我国广东贵屿土壤中PBDEs污染物的含量为0.26～824 ng/g，PBDEs毒理学及生物修复研究亦备受关注[15-17]。4-溴带联苯醚(4-bromodiphenyl ether，BDE-3)作为多溴联苯醚(PBDEs)脱溴反应的终产物之一，多被用于PBDEs的环境行为及生物修复研究。 PBDEs及其衍生物可显著抑制植物的种子萌发和幼苗的生长，诱发植物细胞膜质过氧化[18-19]。植物修复技术利用绿色植物与相关的微生物来降低环境中潜在污染物的毒性，是目前修复重金属和有机污染物污染的重要研究方向[20-21]。目前有关环境重金属及有机污染物的修复研究多集中在单一污染物，而微生物及植物对重金属与有机污染物复合污染的生物响应及机制研究尚少报道。

早期研究发现毛白杨叶际异常维克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)对BDE-3具有较高的耐受性[22]。本研究拟通过观察Cd、Cr、Bap和BDE-3单独或复合暴露条件下毛白杨叶际酵母生长响应情况，分析酵母对4种污染物单独及复合胁迫的解毒、耐受能力，为研究植物和微生物协同修复重金属及有机污染物提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

毛白杨叶际异常维克汉姆酵母由河北农业大学植物修复实验室保存，BDE-3(4-Bromodiphenyl Ether，Lot NDKEK-KN，纯度>98%)购自于东京化成工业株式会社。镉(CdCl2·2.5H2O相对分子质量228.35)购自于天津市永大化学试剂有限公司。铬(Cr)购自于国家有色金属及电子材料测试中心。Bap(纯度96%)，购自于北京百灵威科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 毛白杨叶际酵母对Cd、Cr、Bap和BDE-3胁迫的耐受性分析 将-80 ℃冻存酵母菌株接种于PDB固体培养基中，28 ℃培养16 h。挑取单菌落接种于液体YPD培养基中28 ℃ 200 rpm培养16 h，生长达到对数期，稀释菌液OD600值为1，进行后续试验。

采用平板划线法将酵母菌液涂在含有污染物的PDB固体培养基上，设置不同污染物的浓度梯度，Cd(10 mg/L、100 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L)，Cr(1 mg/L、10 mg/L、30 mg/L、50 mg/L)，Bap(0.25 mg/L、2.5 mg/L、25 mg/L、250 mg/L)，BDE-3(3 mg/L、30 mg/L、300 mg/L)，28 ℃培养36 h后观察酵母生长状况，每个处理均设置3个重复，初步分析酵母对几种污染物是否具有耐受性。

1.2.2 不同剂量Cd、Cr、Bap和BDE-3胁迫对酵母生长的影响 相同体积YPD液体培养基中分别添加Cd、Cr、Bap和BDE-3,设置浓度梯度分别为，Cd(10 mg/L、100 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L)，Cr(1 mg/L、10 mg/L、30 mg/L、50 mg/L)，Bap(0.25 mg/L、2.5 mg/L、25 mg/L)，BDE-3(3 mg/L、30 mg/L、300 mg/L)。取稀释后OD600值为1的菌液100 μL加入含有污染物的YPD液体培养基中，28 ℃ 200 rpm条件下培养。分别在12 h、24 h、48 h和72 h 检测菌液OD600，每个处理均设置3个重复。

1.2.3 不同剂量Cd、Cr、Bap和BDE-3复合胁迫对酵母生长的影响 相同体积YPD液体培养基和无机盐液体培养基中分别添加Cd、Cr、Bap和BDE-3,设置不同处理组合：BDE-3(3 mg/L)+Cd(10 mg/L)、BDE-3(30 mg/L)+Cd(10 mg/mL)、BDE-3(3 mg/L)+Cr(10 mg/L)、BDE-3(30 mg/L)+Cr(10 mg/L)、Bap(2.5 mg/L)+Cd(10 mg/L)、Bap(25 mg/L)+Cd(10 mg/L)、Bap(2.5 mg/L)+Cr(10 mg/L)、Bap(25 mg/L)+Cr(10 mg/L)。取稀释后OD600值为1的菌液100 μL加入含有污染物的YPD及无机盐液体培养基中，28 ℃ 200 rpm条件下培养。分别12 h、24 h、48 h和72 h检测菌液OD600，每个处理均设置3个重复。

1.3 数据分析

使用SPSS analysis 20软件进行单因素方差分析(ANOVA)中Duncan检验进行显著性分析，P<0.05表示显著差异。通过OriginPro 8.5软件绘制图表，图点顶部中“*”表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 毛白杨叶际酵母对Cd、Cr、Bap和BDE-3胁迫的耐受性分析

平板划线试验结果见图1。

图1 4种污染物不同浓度处理条件下酵母生长状况Figure 1 Yeast growth under different concentrations of four kinds of pollutants

由图1可知，和空白对照相比，在试验设计的浓度范围内，10 mg/L Cr和Cd处理均对酵母生长有一定的抑制效应，但抑制效果不显著。Cr对毛白杨叶际异常维克汉姆生长显著抑制的处理浓度为30 mg/L，Cd为100 mg/L。PDB固体培养基中添加3 mg/L BDE-3条件下的酵母生长状况与空白相比并无显著差异差异，30 mg/L及300 mg/L处理下，酵母生长均受到一定程度的抑制。0.25 mg/L及2.5 mg/L Bap处理条件下，酵母生长状况与空白对照相比并无差异，25 mg/L、250 mg/L处理条件下酵母生长受到一定程度的抑制。综上所述，酵母对Cd、Cr、BDE-3和Bap具有较高的耐受性，而且对BDE-3及Bap的耐受性明显高于对Cr和Cd。

2.2 YPD培养基添加不同剂量Cd、Cr、Bap和BDE-3胁迫对酵母生长的影响

YPD营养培养基条件下，不同浓度Cd处理对酵母生长的影响见图2。

图2 不同浓度Cd处理条件下酵母生长状况Figure 2 Yeast growth under different concentrations of Cd

由图2可知，和对照处理相比，10 mg/L以及100 mg/L Cd处理对酵母生长无影响，但10 mg/L Cd处理下48 h可显著促进酵母生长(P<0.05)。500 mg/L 以及1 000 mg/L Cd 可显著机制酵母生长(P<0.05)。结果显示酵母对Cd的单独胁迫具有一定耐受性。Cd在10 mg/L处理条件下48 h显著促进酵母生长(P<0.05)，可能是毒物兴奋效应所致。

YPD营养培养基条件下，不同浓度Cr处理下酵母生长情况见图3。

图3 不同浓度Cr处理条件下酵母生长状况Figure 3 Yeast growth under different concentrations of Cr

由图3可知，Cr在1 mg/L、10 mg/L处理下，对酵母生长没有影响。在30 mg/L、50 mg/L处理下显著抑制酵母的生长(P<0.05)，但30 mg/L处理下72 h处对酵母生长和对照处理没有显著差异。结果显示酵母对Cr的单独胁迫具有一定耐受性。

YPD营养培养基条件下，不同浓度Bap处理下酵母生长情况见图4。

图4 不同浓度Bap处理条件下酵母生长状况Figure 4 Yeast growth under different concentrations of Bap

由图4可知，Bap在0.25 mg/L、2.5 mg/L 2个浓度处理下，对酵母生长无影响。在2.5 mg/L处理下12 h和25 mg/L处理下12 h，48 h处理下吸光度显著高于空白对照(P<0.05)，表现出促进效应，在25 mg/L处理下24 h、72 h处Bap处理下对酵母生长无显著影响，结果显示酵母对Bap单独胁迫具有一定耐受性。

YPD营养培养基条件下，不同浓度BDE-3处理下酵母生长情况见图5。

图5 不同浓度BDE-3处理条件下酵母生长状况Figure 5 Yeast growth under different concentrations of BDE-3

由图5可知，和对照相比，BDE-3在3 mg/L处理下12 h，30 mg/L、300 mg/L处理12 h、24 h显著抑制酵母生长(P<0.05)，48 h、72 h对酵母生长无影响。综上所述，BDE-3在3 mg/L处理下，对酵母的生长无影响，结果显示酵母对BDE-3的单独胁迫具有一定耐受性，30 mg/L、300 mg/LBDE-3初期对酵母生长有显著抑制作用，后期没有影响，推测可能是因为随着时间延长，培养基中BDE-3被酵母修复而是浓度降低。

2.3 YPD培养基中添加不同剂量Cd、Cr、Bap和BDE-3复合胁迫对酵母生长的影响

YPD培养基中加入Cd与BDE-3和Bap组合处理条件下酵母的生长情况见图6。

图6 Cd与不同浓度BDE-3、Bap处理条件下酵母生长状况Figure 6 Yeast growth under Cd with different concentrations of BDE-3、Bap

由图6可知，和对照相比，3 mg/L BDE-3与Cd组合处理对酵母生长无显著影响，30 mg/L BDE-3与Cd组合处理12 h、24 h、48 h显著抑制酵母生长，这与单独胁迫试验中BDE-3处理初期对酵母生长有抑制作用相符。2.5 mg/L Bap与Cd组合处理12 h吸光度与空白对照吸光度相比有显著差异显著促进酵母生长，剩余3个时间点对酵母生长无影响。25 mg/L Bap与Cd组合处理下对酵母生长无影响。与单独胁迫试验结果一致。根据图中数据表明酵母对Cd+BDE-3、Cd+Bap污染物组合污染具有一定耐受性。

YPD培养基中加入Cr与BDE-3和Bap组合处理条件下酵母的生长状况见图7。

图7 Cr与不同浓度BDE-3、Bap处理下酵母生长状况Figure 7 The growth status of yeast under Cr and different concentrations of BDE-3、Bap

由图7可知，和对照相比，3 mg/L BDE-3与Cr组合处理12 h显著抑制酵母生长，后期对酵母生长无影响。30 mg/L BDE-3与Cr组合处理，显著抑制酵母生长。2.5 mg/L、25 mg/L Bap与Cr处理，各个时间点处光度与空白对照吸光度相比无显著差异。表明2.5 mg/L、25 mg/L Bap与Cr的组合对酵母生长无影响，表明酵母对Cr+BDE-3、Cr+Bap污染物组合污染具有一定耐受性。

2.4 无机盐培养基添加不同剂量Cd、Cr、Bap和BDE-3复合胁迫对酵母生长的影响

无机盐培养基中加入Cd 与BDE-3和Bap组合处理条件下酵母的生长状况见图8。

图8 无机盐培养基及Cd与不同浓度BDE-3、Bap处理下酵母生长状况(吸光度)Figure 8 The growth status of yeast under the treatment of inorganic salt basic medium with Cd and different concentrations of BDE-3、Bap

由图8可知，和对照相比，3 mg/L BDE-3与Cd组合处理对酵母生长无显著影响；30 mg/L BDE-3与10 mg/L Cd组合处理24 h对酵母生长无显著影响，48 h、72 h可显著促进酵母生长。2.5 mg/L Bap与10 mg/L的Cd的组合处理在试验设置的时间范围内对酵母生长不显著影响，25 mg/L Bap与Cd组合处理下12 h、24 h可显著促进酵母生长，表明毛白杨叶际异常维克汉姆酵母在无机盐条件下可以利用4-溴代联苯醚(BDE-3)和Bap作为碳源维持较低水平的生长。毛白杨叶际酵母在无机盐培养基条件下利用BDE-3作为碳源的能力强于Bap。

无机盐培养基中加入Cr与BDE-3和Bap组合处理条件下酵母的生长状况见图9。

图9 无机盐培养基及Cr与不同浓度BDE-3、Bap处理下酵母生长状况Figure 9 Yeast growth under the treatment of inorganic salt basic medium with Cr and different concentrations of BDE-3、Bap

由图9可知，3 mg/L BDE-3与10 mg/L Cr组合处理下各个时间点的吸光度与空白对照相比无显著差异，对酵母生长无影响。30 mg/L BDE-3与Cr组合处理下24 h处吸光度与空白对照相比无显著差异，12 h、48 h、72 h处吸光度与空白对照相比有显著差异，且48 h、72 h处显著促进酵母的生长。2.5 mg/L、25 mg/L Bap与10 mg/L Cr组合处理下各个时间点的吸光度与空白对照相比无显著差异，对酵母生长无影响，表明酵母在无机盐条件下可以利用4-溴代联苯醚(BDE-3)作为碳源维持较低水平的生长。

3 讨论与结论

无机盐培养基条件下加入重金属Cd、Cr单独胁迫，酵母无法正常生长，无机盐培养基条件下，25 mg/L Bap+10 mg/L Cd、30 mg/L BDE-3+10 mg/L Cd、30 mg/L BDE-3+10 mg/L Cr组合处理均可显著促进酵母生长。苋菜、牛尾草等植物对5～50 mg/L的BDE-209的暴露有类似生物响应，表现为一定剂量的BDE-209可以降低重金属对植物生长和发育产生的毒性作用[23]。

较高浓度CdCl2(50 mg/kg)也可使大豆幼苗发育不完全[24]，二价Cd含量在农作物中超过1 mg/kg就会导致农作物中元素失衡，从而产生如细胞功能缺失，叶绿素含量减少、光合作用降低等一系列不良反应[25]。本研究发现YPD营养培养基条件下，单独低浓度(10 mg/L、100 mg/L) Cd处理对酵母生长无显著影响，但高剂量500 mg/L Cd处理则显著抑制酵母的生长，和高等植物相比酵母对Cd有较高的耐受，这可能与生物代谢个体差异有关。目前环境中存在的重金属元素Cr多为三价和六价，其中六价Cr毒性较强，零价Cr研究较少，有关内容尚需进一步研究。

BDE-3胁迫初期对酵母生长有显著抑制作用，后期没有影响，推测可能是因为随着时间变化，培养基中BDE-3被酵母修复利用所致。无机盐培养基条件下污染物复合暴露试验表明，BDE-3与Cd、Cr组合胁迫下的酵母生长情况整体优于Bap与Cd、Cr组合胁迫下酵母生长情况，推测毛白杨叶际酵母在无机盐培养基条件下利用BDE-3作为碳源的能力强于Bap，有关机制尚需进一步研究。

毛白杨叶际异常维克汉姆酵母对Cd、Cr、Bap和BDE-3单独暴露以及Cd+Bap、Cd+BDE-3、Cr+Bap、Cr+BDE-3复合胁迫均具有较高的耐受特性；同时毛白杨叶际异常维克汉姆酵母在无机盐条件下可以利用BDE-3和Bap作为碳源维持较低水平的生长，并且利用BDE-3为碳源能力优于利用Bap的能力。