球孢白僵菌Bb09侵染美国白蛾的扫描电镜观察及其致病性

杨苗，李英，郭建刚，任海潮，许子怡，李会平，3

(1 河北农业大学 林学院，河北 保定 071000；2 河北雾灵山国家级自然保护区管理中心，河北 承德 067300；3 河北省城市森林健康技术创新中心，河北 保定 071000)

美国白蛾(Hyphantriacunea)属鳞翅目灯蛾科，又称秋幕毛虫、网幕毛虫等，原产于北美洲，是一种外来入侵有害生物，因具有食性杂、繁殖量大、危害严重等特点，被列为重大林业有害生物[1]。自1979年美国白蛾在我国辽宁省首次发现，到2020年已危及到我国13个省级，598个县级行政区[2]。目前防治美国白蛾的方法主要有化学防治、生物防治、生态防治、人工防治等[3-6]。研究表明农药制剂0.5% 藜芦碱 WP 对美国白蛾幼虫具有良好的致死效果，浓度为10 mg/L藜芦碱 WP 在施用3 d后美国白蛾幼虫达到死亡高峰期[7]。刘子欢等研究了苏云金杆菌对美国白蛾的生长发育影响[8]。李建等试验12种杀虫剂对美国白蛾幼虫的室内毒力测定[9]。但长期使用化学农药易导致害虫产生抗药性，生物防治能有效控制美国白蛾种群数量，同时对环境安全，是一种维持生态平衡和实现可持续控制美国白蛾的无公害防治措施，因而越来越得到公众的认可和重视[10-11]。

白僵菌属是目前研究和应用于害虫生物防治最广泛的一类昆虫病原真菌，其杀虫范围达700多种，具有致病性强，应用范围广，对环境无明显污染等优点，已经广泛运用于二斑叶螨、烟粉虱和蓟马等农林害虫防治[12-15]。在适宜的条件下，白僵菌分生孢子萌发后能通过表皮进入寄主体腔，产生有毒代谢物导致寄主死亡最终侵入寄主器官，穿出体壁重新产生孢子[16]。目前对利用寄生菌防治美国白蛾已有不少报道，如刘永清等筛选出对美国白蛾致病力达94.2 %(孢子浓度为1×109孢子/mL)的高致病性球孢白僵菌Bb11，覃丰全等从22株球孢白僵菌菌株中筛选出高致病力的球孢白僵菌菌株FD，并进行初步野外防治试验，取得良好防治效果[17-18]。李会平等测定来自不同寄主和生境的白僵菌对美国白蛾的致病力，研究了应用白僵菌防治美国白蛾的潜力[19]。但白僵菌侵染美国白蛾的扫描电镜观察及其对美国白蛾卵和不同龄期幼虫致病性的系统研究还未见报道。因此，本研究以球孢白僵菌Bb09菌株为研究对象，采用扫描电镜观察其对美国白蛾幼虫的致病过程，利用喷雾法研究其对美国白蛾卵及不同龄期幼虫的毒力效果，为今后利用球孢白僵菌防治美国白蛾提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

球孢白僵菌Bb09菌株分离自染病柞蚕僵体，并用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养和纯化，由河北农业大学林学院林木病理实验室提供。

供试美国白蛾卵块采自唐山市滦南县国有林场，将卵块置于Φ 9 cm的培养皿中培养至孵化幼虫(培养皿中放置湿棉球，以保证卵发育时所需湿度)，将孵化出的幼虫置于500 mL烧杯中，用新鲜毛白杨叶片进行喂养至不同龄级。

1.2 方法

1.2.1 球孢白僵菌Bb09孢子悬浮液的制备 将分离得到的球孢白僵菌Bb09接种于PDA平板上，于25 ℃恒温培养箱进行产孢培养至分生孢子成熟，用0.5‰ 吐温-80无菌水在无菌条件下将培养成熟的球孢白僵菌分生孢子冲洗到无菌烧杯中，置于磁力搅拌器上均匀打散，配成球孢白僵菌Bb09孢子悬浮液。之后用血球计数板计数，根据现有浓度，用0.5‰ 吐温-80溶液稀释成1×104孢子/mL、1×105孢子/mL、1×106孢子/mL、1×107孢子/mL、1×108孢子/mL以备用。

1.2.2 球孢白僵菌Bb09侵染美国白蛾幼虫的电镜观察 挑取45头3龄幼虫，用灭菌小毛笔蘸取无菌水轻轻扫拭幼虫表面后，用手持小喷壶将浓度为1×108孢子/mL的孢子悬浮液均匀喷于幼虫表面。将处理后的美国白蛾幼虫置于250 mL烧杯中于室温条件下用新鲜毛白杨叶片进行喂养。分别于接种后6 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h、72 h、130 h、192 h进行取样处理，以备扫描电镜观察使用。

样品经2.5%戊二醛进行48 h固定处理，磷酸缓冲液冲洗4次，10 min/次，以保证固定液冲洗完全。1%锇酸固定2 h，后用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%酒精进行逐级脱水，每级30 min，以乙酸异戊酯置换酒精，30 min/次，共2次。临界点干燥(临界点干燥仪型号：LEICA EM CPD 030)，银胶黏铜台喷金(离子溅射仪型号：MCIOOO Ion Sputter)，置于扫描电子显微境 (SU8010)下进行观察、拍照。

1.2.3 球孢白僵菌Bb09对美国白蛾的致病性 用手持小喷壶将不同浓度(1×104～1×108孢子/mL)的孢子悬浮液分别均匀接种美国白蛾卵、1、2、3、4、5、6龄幼虫，接种后卵及幼虫分别置于室温条件下进行保湿培养，并以新鲜毛白杨叶片饲喂各龄幼虫，逐日观察，计算卵的孵化率及各龄幼虫的死亡率。将死亡各龄幼虫置于干净载玻片上，放于培养皿中于25 ℃培养箱进行保湿培养，观察虫体上是否有球孢白僵菌长出，并作为判断是否由球孢白僵菌侵染致死的依据。以0.5‰ 吐温-80无菌水作对照。每个处理重复3次。对卵的致病力测定，每个处理接种100粒卵，对各龄幼虫的致病力测定，每个处理接种30头幼虫。

1.2.4 数据处理 根据生物测定数据，分别计算不同处理卵的孵化率和幼虫的死亡率，并以Abbott公式进行校正，即：

(1)

(2)

(3)

采用SPSS 19.0 软件对卵和不同龄期幼虫的致病力进行统计分析，同时运用DPS软件中时间—剂量—死亡率模型(TDM)对1～3龄幼虫的累计死亡率进行进一步分析(注：当对照死亡率<5%时可忽略不计)。

2 结果与分析

2.1 球孢白僵菌Bb09侵染美国白蛾幼虫的电镜观察

将处理后不同时间的美国白蛾3龄幼虫置于扫描电镜下(SU8010)观察。结果如图1所示。

图1 球孢白僵菌在美国白蛾幼虫体表的生长过程Figure 1 Growth process of B. bassiana on the surface of H.cunea larvae

由图1可知，6 h后，白僵菌孢子成功附着在美国白蛾虫体表面，主要以虫体表面节间褶皱(a)、棘状突起(b)及刚毛基部侧面气孔部位(c)为主，而美国白蛾头部(d)及刚毛部位附着孢子较少(e)；接种18 h后，孢子开始萌发，长出芽状突起(f，g)；24 h后，随着时间的增加，萌发的孢子数量不断增加(h)；接种36 h后，有些芽管指向表皮生长，末端表现出侵入趋势(i)，有些则直接侵入(j)；分生孢子在接种后的48～72 h内进入萌发生长活跃期，在侵入体壁之前，部分芽管会在体表平行生长，遇到合适侵入点便进行入侵，也有部分孢子萌发形成菌丝后再由合适侵入点侵入(k，l)；130 h后，虫体表面布满白色菌丝(m)；192 h体表菌丝形成网状结构，并长出新的分生孢子束(n，o)。

(a) 卵

(b) 1龄幼虫

(c) 2龄幼虫

(d) 3龄幼虫

(e) 4龄幼虫

(f) 5龄幼虫

(g) 6龄幼虫图2 不同浓度球孢白僵菌Bb09孢子悬浮液下美国白蛾卵及幼虫逐日累计死亡率Figure 2 The daily accumulative mortality of the eggs and larvae of H.cunea after treatment with different spore suspension of B.Bassiana Bb09

2.2 球孢白僵菌Bb09对美国白蛾的致病性

2.2.1 球孢白僵菌Bb09对美国白蛾卵及不同龄期幼虫致病力 美国白蛾卵的孵化情况及不同龄期幼虫死亡情况见图2。

由图2可知，球孢白僵菌Bb09对美国白蛾卵的致病力极差，接种7 d后，各浓度下美国白蛾卵的累计孵化率均达到了90%以上。但球孢白僵菌Bb09对美国白蛾不同龄期幼虫均表现出不同的致病力。同一浓度下，其致病力随着虫龄的增加而减小；同一龄期美国白蛾幼虫的死亡率随着孢子浓度的减小而减小。如3龄幼虫在浓度为1×108孢子/mL、1×107孢子/mL、1×106孢子/mL、1×105孢子/mL、1×104孢子/mL孢子悬浮液下第7天的累计死亡率分别达到 87.78%、70.00%、62.22%、42.22%、26.67%。综合分析表明白僵菌Bb09对美国白蛾1、2、3龄幼虫的致病力较好，4龄次之，龄期越小，白僵菌孢子悬浮液的致病力越大且各个浓度下的累计死亡率差异越大。

2.2.2 球孢白僵菌Bb09对不同龄期美国白蛾幼虫的致死中浓度 美国白蛾各龄幼虫的致死中浓度对数值见表1。由于5龄幼虫和6龄幼虫多数死亡率未达到50%，所以未对5龄，6龄幼虫进行LD50计算。

表1 球孢白僵菌Bb09对各龄美国白蛾幼虫的致死中浓度对数值Table 1 Logarithmic value of the median lethal dose of B.Bassiana Bb09 on different larvae of H.cunea

由表1可知，同龄期幼虫在接种不同天数后的LD50对数值随着时间的增加而不断减少，毒力作用不断增加；在同一作用天数下随着幼虫龄期的增加LD50对数值逐渐增加。接种后第2天、第3天只有1、2龄幼虫实际算出LD50，而对3、4龄幼虫的致死剂量效应值LD50理论上可计算，但会高于1、2龄幼虫的实际致死对数值，实际应用意义不大。

2.2.3 球孢白僵菌Bb09对不同龄期美国白蛾幼虫的致死中时 球孢白僵菌Bb09对不同龄期美国白蛾幼虫的致死时间效应见表2。由于1×104孢子/mL孢子悬浮液浓度下各龄期幼虫死亡率均未达到50%，1×105孢子/mL 除1龄幼虫外其他龄期幼虫的死亡率均未达到50%，所以对浓度为1×105孢子/mL、1×104孢子/mL的孢子悬浮下各龄期幼虫LT50未进行计算。

表2 同一孢子悬浮液浓度下球孢白僵菌Bb09对美国白蛾幼虫的致死中时Table2 The median lethal time of the same spore suspension of B.Bassiana Bb09 on larvae of H.cunea

由表2可知，随着孢子悬浮液浓度的增大，同龄幼虫的致死中时(LT50)缩短。在1×104～1×108孢子/mL范围内，1龄幼虫的LT50值由3.93下降到1.32。在相同浓度下，随着幼虫龄期的增加其LT50值也逐渐升高，1×108孢子/mL下，5龄幼虫的LT50为6.29，而1龄幼虫仅为1.32。球孢白僵菌Bb09对5龄、6龄幼虫的致病力较差。

2.2.4 球孢白僵菌Bb09对不同龄期美国白蛾幼虫TDM模型分析 以上结果表明球孢白僵菌Bb09对美国白蛾1～3龄幼虫表现出良好致病力。为探讨剂量效应与时间效应之间的相互关系，用TDM (时间—剂量—死亡率)模型对测得的球孢白僵菌Bb09对美国白蛾1～3龄幼虫的毒力测定数据进行下一步分析,更好反映菌株应用潜力。测定的TDM模型各参数估计结果见表3。

表3 球孢白僵菌Bb09对美国白蛾1～3龄幼虫的TDM模型模拟与参数估计Table 3 Parameters estimated by fitting the time-dose-mortality (TDM)model to assay data of B.Bassiana Bb09 against the 1～3 instars larvae of H.cunea

由从表3可知，根据美国白蛾1、2、3龄幼虫剂量效应的斜率β来看，2龄幼虫对孢子悬浮液浓度的变化最为敏感，β值为0.515 9。不同虫龄下τj值随作用时间的增加而增加，试验后期增加幅度减小，说明幼虫的累计死亡率受到剂量与时间双重因素的影响，在试验后期美国白蛾幼虫的死亡率呈逐渐上升趋势并趋于稳定。各处理剂量与时间效应参数的t测验值均达到极显著水平(P<0.000 1),说明供试球孢白僵菌Bb09菌株的剂量效应与时间效应极显著。在条件死亡概率模型中，γi最大值出现的天数与试验中所观察到的死亡高峰期相吻合。

各龄期所建TDM模型均通过Hosmer-Lemeshow拟合异质性检验，所建各处理模型均不存在异质性,能够无偏描述各浓度下球孢白僵菌孢子悬浮液与美国白蛾幼虫死亡率的相互作用关系。

2.2.5 球孢白僵菌Bb09对不同龄期美国白蛾幼虫致死作用的剂量效应 关于白僵菌Ba09对美国白蛾1～3龄幼虫的致死剂量对数值见图3。

(a)1龄幼虫

(b)2龄幼虫

(c)3龄幼虫

由图3可知，根据TDM模型估计出球孢白僵菌Bb09侵染不同龄期幼虫不同时间的剂量效应。随着试验后接种天数的增加，LD50、LD90的剂量对数值不断减少，剂量效应不断增强。球孢白僵菌Bb09对1、2、3龄幼虫的剂量效应在试验接种后的前4 d变化较明显，说明这期间各龄期幼虫的死亡率变化较大，之后趋于平稳。由于3龄幼虫在接种3 d时未出现大量死亡，累积死亡未达到90%，所以模型估计的LD50，LD90偏大。

2.2.6 球孢白僵菌Bb09对不同龄期美国白蛾幼虫致死时间效应 球孢白僵菌Bb09对不同龄期美国白蛾幼虫致死作用的时间效应见表4。

表4 球孢白僵菌Bb09对美国白蛾1～3龄幼虫的LT50和LT90Table 4 The values of LT50 and LT90 for B.Bassian Bb09 against the 1～3 instars larvae of H.cuneaa

由表4可知，1、2、3龄幼虫的LT50值与孢子悬浮液浓度呈反比，即随着孢子悬浮液浓度的增加，各龄期LT50值减少。LT90值只有1、2龄幼虫在1×108孢子/ mL高浓度孢子悬浮液下才能达到，分别为3.97 d、4.88 d。以上结果表明1龄幼虫致死所需时间最短。

3 讨论与结论

通过观察被球孢白僵菌Bb09侵染的美国白蛾体表特征，并详细分析其致病性，利用TDM模型分析时间与剂量之间的相互作用，为防治美国白蛾提供依据。本研究在观察球孢白僵菌Bb09对美国白蛾侵入过程中发现，分生孢子在美国白蛾体表的附着、萌发、侵入等过程存在时间和状态上的不同。有的孢子在表面萌发较快，有的较慢，有的孢子萌发后即可侵入，有的则在体表进行平行生长遇到合适的侵入点再侵入，出现这些现象的原因可能与美国白蛾体表结构、特殊部位的物质含量有关。这和前人的研究有很大的相似性，王音等发现绿僵菌孢子侵染小菜蛾前的生长状态与小菜蛾体表形状存在着关系[20]；本试验中发现球孢白僵菌分生孢子以芽管或菌丝形式入侵美国白蛾表皮，这和前人研究结果稍有不同。这可能和美国白蛾幼虫体表营养物质有关，当寄主表皮分泌的营养物质利于孢子生长时，孢子便可萌发形成芽管或生长为菌丝。

真菌侵染宿主卵的研究报道相对较少，在已有少数研究报道中发现，真菌对卵侵染力大小也存着较大差异性。如彭军测定了球孢白僵菌对朱砂叶螨卵的侵染率达到50%[21]；Shi等研究发现球孢白僵菌对害螨卵的侵染毒力则达67.4%[22]；本试验研究发现球孢白僵菌Bb09对美国白蛾卵无致病力。分析原因可能是因为覆盖在虫卵表面的雌蛾鳞片阻碍了芽管的穿透；也可能是虫卵表面所特有的保护结构或分泌物质阻碍或抑制了孢子的萌发、侵染。但试验中发现菌液侵染卵虽未大量死亡，遗留于卵体表或培养皿上的白僵菌孢子对刚孵化幼虫仍具有侵染致病力，这就为林间实际应用提供了参考，可在卵孵化后期进行防治，这对控制美国白蛾幼虫的后期繁殖数量意义重大。

通过致病性测定发现球孢白僵菌Bb09对美国白蛾1～3龄幼虫的毒力较好，在1×108孢子/mL高浓度下， 1～3龄幼虫累计死亡率均高达90%左右。通过TDM模型分析球孢白僵菌Bb09对美国白蛾1～3龄幼虫的毒力，2龄幼虫对球孢白僵菌Bb09孢子悬浮液浓度变化的敏感度最高。模型分析同时考虑了时间和剂量之间的相互效应，体现生物特定的完整性和客观性。虽然室内测定表明球孢白僵菌对美国白蛾具有很好的防治效果，但为更好的在实际中应用，可以进行适当的田间试验，并可尝试和一些植物源农药进行相容性研究，为今后防治美国白蛾提供更好更环保的方法。