外周血Periostin表达水平与股骨头坏死塌陷进程的相关性研究

苏敬阳，曹 斌，张耀杰，郝学伟，王 寅，于海泉（石家庄市人民医院骨科三病区,石家庄050000）

股骨头坏死是指由多种原因导致的股骨头血供中断或受损，进而引起骨髓成分和骨细胞因缺血缺氧而凋亡或坏死，诱发股骨头结构发生变化甚至塌陷的一系列病理改变和临床表现[1-2]。目前认为股骨头坏死的发病机制主要包括脂质代谢紊乱学说、骨细胞凋亡学说、骨内压增高学说、血管内凝血与血管损伤学说、基因控制学说等[3-4]。Periostin 最早是从小鼠成骨细胞系中克隆出来的一种黏附分子，对骨细胞的分化具有调节作用，在骨骼生长的不同阶段会有不同程度的表达[5]，但是其与股骨头坏死塌陷进程的关系尚未有报道，因此本研究主要考察外周血Periostin表达与股骨头坏死塌陷进程的关系，以期为股骨头坏死塌陷进程的临床诊断提供参考指标。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2016年8月～2019年5月石家庄市人民医院收治的110 例股骨头坏死患者作为研究组。男性73 例，女性37 例；平均年龄42.30±8.47 岁，国际骨循环研究会（Association Research Circulation osseous,ARCO）分期为Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ期的分别有33 例，41 例和36 例；病因为酒精、激素、特发、创伤的分别有37 例，41 例，16 例和16 例；塌陷前70 例，塌陷后40 例。纳入标准：所有患者年龄均在18～65 岁范围内；所有患者均符合股骨头坏死临床诊疗规范的诊断标准[6]（2012年，中华医学会骨科学分会关节外科组）；所有患者均符合ARCO 分期Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ期。另纳入我院同期进行体检的110 例非股骨头坏死受试者作为对照组，男性70 例，女性40 例；平均年龄42.14±9.20 岁。研究组和对照组研究对象均无糖尿病、高血压、冠心病及HIV 等疾病史；近半年内均未服用过降脂类药物、激素或对骨代谢有影响的药物。两组研究对象的性别及年龄等基本资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究获得本院伦理委员会审核批准，研究严格遵照赫尔辛基宣言，所有患者均知情且已自愿签订知情同意书。

1.2 仪器与试剂 仪器：离心机、高精度加样器及枪头（5～1 000 μl）（Eppendorf 公司），多功能酶标仪（Molecular Devices 公司），恒温箱（上海精宏实验设备有限公司），冰箱（海尔公司）。试剂：Periostin标准品（南京赛泓瑞），缓冲液、亲和素-HRP试剂（北京百奥莱博科技有限公司），TMB 底物（基因有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本采集：所有受试者均禁食8 h 以上，于清晨抽取受试者肘静脉血，放入到加有柠檬酸钠抗凝的试剂管中，1 000 g 离心15 min，用移液器将上层血浆移至另一干净的试剂管中，编号，放置于-20℃冰箱中备用。对患者定期进行随访，并在随访中确诊为塌陷后的第二日按上述方法采集血浆样本。

1.3.2 实验准备：使用样本稀释液将样本（血浆）稀释至所需浓度。使用样本稀释液配制梯度浓度的Periostin 标准品。取100 μl 1×缓冲液加入生物素化的抗体试剂瓶中配制生物素化抗体浓缩液，混匀后，用1×缓冲液将其稀释80 倍备用。摇晃装有亲和素-过氧化物酶试剂的试剂瓶使其混合均匀，用1×缓冲液稀释100 倍备用。

取100 μl 梯度浓度的标准品和实验样本分别放入微孔酶标板标准品孔和样板孔内，用封板膜封住板孔，并在室温培育2.5 h。倒掉微孔酶标板内的液体并冲洗，然后将微孔酶标板倒置放于干净的纸巾上。于每一个板孔中加入100 μl 的生物素化抗体试剂，室温培育1 h，然后倒掉液体，冲洗，然后加入100 μl 亲和素-过氧化物酶试剂，室温培育45 min，倒掉液体，冲洗，加入100 μl TMB 底物，避光室温培育30 min，然后加入50 μl 终止液，停止反应30 min 内使用多功能酶标仪（Molecular Devices 公司）进行微孔酶标板的测量读数，并计算各样品的Periostin 蛋白浓度。

1.4 统计学分析 采用 SPSS22.0 软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间两样本比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料用百分数形式表示，采用χ2检验；相关性分析采用Pearson 分析；建立受试者工作特征（ROC）曲线评价诊断效能。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 研究组和对照组受试者Periostin水平比较受试者外周血中Periostin水平（0.86±0.17）显著高于对照组（0.65±0.10），差异有统计学意义（t=11.167，P＜0.05）。

2.2 研究组不同病因及分期受试者Periostin水平比较 见表1。研究组患者中ARCO 不同分期组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05），且Ⅲ期和Ⅳ期患者外周血中Periostin水平显著高于Ⅱ期患者，组间比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）。病因为酒精性、激素性、特发性及创伤性患者外周血中Periostin水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 研究组不同病因及分期受试者Periostin水平比较

2.3 研究组塌陷前后Periostin水平比较 随访期间，共有40 例患者发生塌陷。发生塌陷患者股骨头坏死塌陷后外周血中Periostin 浓度（0.92±0.23）比塌陷前（0.67±0.11）显著升高，差异有统计学意义（t=6.465，P＜0.05）。

2.4 研究组Periostin水平与ARCO 分期的相关性分析 研究组Periostin水平与ARCO 分期呈正相关（r=0.563，P＜0.05）。

2.5 Periostin 在股骨头坏死塌陷的诊断效能分析 见图1。采用ROC 曲线评估外周血中Periostin水平对股骨头坏死塌陷的诊断效能，结果显示，股骨头坏死塌陷患者外周血中Periostin 的AUC 及95%CI 为0.841（95%CI，0.786～0.895，P＜0.001），提示外周血中Periostin 对股骨头坏死塌陷诊断效能较高。

图1 外周血中Periostin 在股骨头坏死塌陷的诊断效能

3 讨论

股骨头坏死是临床上骨科常见的一种难治性的骨关节病，股骨头血供受损是目前公认的股骨头坏死的始动因素，股骨头坏死后自身修复不充分会致使股骨头的局部结构发生变化，致使软骨被破坏或股骨头局部塌陷等，最终引起严重的功能障碍疾病[7-9]。目前国内外专家公认的股骨头坏死的发病机制的学说主要包括：脂质代谢紊乱及骨内压增高学说、血管内凝血与血管损伤学说、骨细胞凋亡学说、基因控制学说等[10-11]。

Periostin 最初被称为骨细胞特异性因子-2，后来陆续发现于牙周韧带及骨膜，改名为Periostin。Periostin 蛋白含有835 个编码氨基酸，拥有自己的信号结构，主要表达并分泌在心肌成纤维细胞[12]。有专家发现Periostin 蛋白对机体成骨细胞的分化具有一定的调节作用，进而在机体的生长和发育过程中发挥作用[13]。Periostin 蛋白主要通过两种方式进行信号的传导：①非整合素受体介导的Periostin 蛋白信号的传导：Periostin 可以通过与Notch 1 结合使Bcl-cl基因的表达上调，进而促进成骨细胞的分化作用，抑制机体细胞死亡，促进骨骼的改建和塑性[14]。②整合素受体介导的Periostin 蛋白信号的传导：Periostin 蛋白可与整合素受体ανβ3 结合，进而对机体中硬骨素的表达起到抑制作用，而硬骨素主要通过调节BMP 和wnT信号传导抑制骨细胞的形成，因此Periostin 蛋白可以促进骨细胞的形成[15-16]。研究证实Periostin 蛋白与牙、骨等矿化组织的形成和再生有密切关系，其在骨骼生长的不同阶段会有不同程度的表达，通过调节骨细胞的增殖和分化影响骨骼的形成[17-18]。研究显示骨骼生长过程中Periostin 蛋白的表达水平显著高于成年后骨骼中的表达水平，且破坏骨骼的纤维结构后，Periostin 蛋白的表达水平会增加[19-20]。通过对大鼠的研究显示成年大鼠肌肉或骨骼受损后，Periostin蛋白的表达水平会显著增加；体外培养小鼠中已经敲除Periostin 蛋白表达的调控基因后的成骨细胞，结果显示这些细胞的增殖和分化能力显著降低[18-20]。表明Periostin 蛋白是骨代谢中重要的蛋白，在骨骼的生长发育过程中具有重要作用[21]。

本研究结果显示，研究组受试者外周血中Periostin水平显著高于对照组。研究组患者中ARCO Ⅲ期和Ⅳ期患者外周血中Periostin水平显著高于Ⅱ期患者，且Periostin水平与ARCO 分期呈正相关。研究组患者股骨头坏死塌陷后与塌陷前相比外周血中Periostin水平显著升高。且外周血中Periostin 对股骨头坏死塌陷诊断效能较高。提示外周血中Periostin对股骨头坏死患者的股骨头塌陷进程的判断具有一定的指导意义，可为股骨头坏死塌陷的临床诊断提供一定的参考价值。

综上，外周血中Periostin表达与股骨头坏死塌陷有密切关系，股骨头坏死塌陷后外周血中Periostin水平显著升高，对股骨头坏死患者的股骨头塌陷程度的判断具有一定的指导意义，可为股骨头坏死后塌陷的临床诊断提供一定的参考价值。