冷冻期间猪肌内脂肪氧化及肌纤维蛋白凝胶性能的差异分析

尉立刚，孙文艳，范三红，李倩，杨钰昆，郭彩霞

（山西大学生命科学学院，山西 太原 030006）

猪肉，作为我国肉类消费的主体，是人们日常饮食中重要的组成部分。统计显示：2018年我国猪肉的消费量高达6.90亿头[1]，占肉类总产量的63.45%。冷冻储藏，作为一种经济便捷的保存方法，在肉类产业中广泛应用[2]。但是，原料肉在低温冻藏过程中，其蛋白质和脂肪将会发生一定程度的氧化，导致其品质下降[3]。

目前，关于原料肉在冻藏过程中理化性质的改变已引起国内外相关学者的关注。李倩等人[3]研究了低温冻藏时间对原料猪肉中肌原纤维蛋白氧化程度的影响，结果表明：随冻藏时间的延长，猪肉中肌原纤维蛋白的羰基含量显著增加，而内源性色氨酸荧光、总巯基和表面疏水性显著下降（p<0.05）。赵钜阳等[4]调查了冷冻储存时间对生猪肉品质的影响，结果发现：随冻藏时间的增加，生猪肉中可溶性蛋白质和弹性显著降低，而POV、TBARS以及游离氨基酸的含量呈现升高趋势。此外，随冻藏时间延长，生猪肉中的风味物质差异显著。因此，生猪肉的品质随着冻藏时间的延长而显著下降，尤其是冻藏120 d后，其品质下降明显。Brewer等[5]调查了冻藏时间对真空包装的猪肉中脂肪氧化的影响后发现：猪肉中脂肪氧化程度随冻藏时间的延长而显著增加。以上研究多集中在原料肉冻藏过程中蛋白质氧化、可溶性蛋白质、游离氨基酸以及原料肉脂肪氧化等方面，而很少涉及到冷冻时间对猪肌内脂肪及肌原纤维蛋白凝胶性能影响的相关报道。

试验拟以新鲜猪肉为研究对象，-18 ℃下分别冻藏0、1、4、8、12周后，探究冷冻时间对猪肌内脂肪和肌原纤维蛋白溶解度、保水性、凝胶白度及强度的影响，以期为猪肉冷冻过程中肌内脂肪及肌原纤维蛋白凝胶性能的改变提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

将屠宰后 24 h的猪脊肉（大白猪，180日龄，pH=5.8，亮度值：42.7，红度值：3.7，黄度值：7.3）置于冰盒中保藏；乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA），上海罗恩试剂有限公司；1,4-哌嗪二乙磺酸（PIPES，纯度98%），北京索莱宝科技有限公司；硫代巴比妥酸（TBA，分析纯），天津市光复精细化工研究所；氯仿、甲醇、正己烷、盐酸、氢氧化钾，分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

Starter2100型pH计，上海奥豪斯仪器有限公司；QT-1型涡旋振荡器，上海琪特分析仪器有限公司；NS800型分光测色仪，深圳市三恩时科技有限公司；DZ-400/2SK型真空包装机，上海青葩食品包装机械有限公司；GC-2010型气相色谱仪，日本岛津公司；Agilent1100型液相色谱仪，安捷伦科技（中国）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 猪脊肉的冻藏

将上述置于冰盒的猪外脊肉运抵试验室，随后剔尽脂肪组织，垂直于肌纤维纹路的方向将猪脊肉分割成100 g左右的肉块，封装后在-18 ℃分别冻藏0、1、4、8和12周，以备肌原纤维蛋白的提取及以下理化指标的测定。

1.2.2 肌原纤维蛋白的提取

依据Yu等[6]的方法，对肌原纤维蛋白进行提取。将上述冻藏的猪肉在4 ℃下解冻，切割成条状，按1:4（g/mL）的比例加磷酸盐缓冲液（10 mmol/L磷酸钠，0.1 mol/L氯化钠，2 mmol/L氯化镁，1 mmol/L EGTA，pH=7.0），置于均质机均质60 s，随后，在3340 r/min离心15 min，弃上清液，重复上述操作三次。按1:4（g/mL）的比例加入0.1 mol/L的NaCl溶液，搅拌，用0.1 mol/L的HCl调pH至6.25，用四层纱布过滤，离心弃上清液，得肌原纤维蛋白。以BSA为标准品，双缩脲法测定肌原纤维蛋白浓度。

1.2.3 肌原纤维蛋白中残余脂肪氧化值的测定

肌原纤维蛋白中残余脂肪的氧化程度参照Yu等[7]的方法进行测定。称2.0 g左右的肌原纤维蛋白于50 mL烧杯中，随后加入3 mL 1%的TBA溶液（0.075 mol/L的NaOH为溶剂）和17 mL 2.5%的TCA溶液（0.036 mol/L的HCl为溶剂），混匀后移至比色管，加热煮沸0.5 h，冷却至室温。随后，取10 mL上清液于25 mL比色管中，加入10 mL氯仿，涡旋仪振荡混匀，在4500 r/min下离心15 min。取6 mL上清液，加入3 mL石油醚，涡旋仪振荡混匀，在上述相同转速下离心，取下层液在532 nm处测定吸光度。同时以2 mL的PIPES溶液（15 mmol/L）代替样品作试验空白。肌原纤维蛋白中残余脂肪的TBARS按公式(1)计算。

式中：

A1——样品的吸光度；

A2——空白的吸光度；

m——肌原纤维蛋白的质量，g。

1.2.4 肌原纤维蛋白溶解度的测定

依据曹云刚等[8]的研究方法对肌原纤维蛋白的溶解度进行测定。用15 mmol/L的PIPES缓冲液（含0.6 mol/L NaCl，pH=6.25）将提取出的肌原纤维蛋白稀释为2 mg/mL，搅拌60 min（4 ℃），4500 r/min离心0.5 h。吸取1 mL上清液，加入4 mL碱性酒石酸铜溶液，37 ℃水浴中反应0.5 h，540 nm比色，同时以蒸馏水做空白。蛋白溶解度按公式（2）计算。

式中：

C1——上清液液中肌原纤维蛋白浓度，mg/mL；

C2——肌原纤维蛋白浓度，mg/mL。

1.2.5 肌原纤维蛋白凝胶的制备

凝胶的制备方法参照曹云刚等人[8]的描述。首先，将肌原纤维蛋白用15 mmol/L的PIPES缓冲液稀释至30 mg/mL，随后分别称取稀释过的肌原纤维蛋白约5.0 g于10 mL烧杯（测定肌原纤维蛋白的保水性）中，约30 g于50 mL烧杯（测定肌原纤维蛋白的白度及凝胶强度）中，保鲜膜密封烧杯，在程序升温水浴锅中以10 ℃/min的升温速率从25 ℃加热至75 ℃，保持20 min，随后冰浴中冷却0.5 h，以备保水性、白度和凝胶强度的测定。

1.2.6 肌原纤维蛋白凝胶保水性的测定

参照贾娜等[9]的方法对凝胶保水性进行测定。具体如下：将上述制备的凝胶（约5.0 g）放入50 mL离心管（m1），离心10 min（3000 r/min，4 ℃），随后将离心管倒置于滤纸上20 min，称重（m3）。凝胶保水性按公式（3）计算。

式中：

m1——离心前肌原纤维蛋白凝胶样品的质量，g；

m2——离心管的质量，g；

m3——经吸水后凝胶和离心管的质量，g。

1.2.7 肌原纤维蛋白凝胶白度的测定

参照夏秀芳等人[10]的方法对凝胶白度进行测定。将上述制备的肌原纤维蛋白凝胶置于室温下平衡 30 min。采用 3nh分光测色仪对样品的白度进行测定，记录L*、a*和b*值。凝胶白度按公式（4）计算。

式中：

L*——亮度值；

a*——红度值（正、负值分别表示偏红、偏绿）；

b*——黄度值（正、负值分别表示偏黄、偏蓝）。

1.2.8 肌原纤维蛋白凝胶强度的测定

参照曹云刚等人[8]的方法对肌原纤维蛋白的凝胶强度进行测定。将上述制备的肌原纤维蛋白凝胶在25 ℃下平衡 30 min，用滤纸吸去样品表面水分，用TMS-PRO质构仪对蛋白凝胶强度进行测定。仪器的参数为：圆柱塑胶探头（TMS 25.4 mm），测试速度：30 mm/min，起始力：0.050 N；穿刺距离：4 mm；回升距离：50 mm。探头刺破凝胶所需压力即为肌原纤维蛋白的凝胶强度。

1.2.9 数据分析

试验均设为三次重复（不同日期），结果用均值±标准偏差的形式表示。试验数据用Statistix 9.0软件进行方差分析和显著性分析（LSD法），文章中的图均用Origin 8.5进行绘制，试验结果中的不同字母代表差异显著（p<0.05）。

2 结果与分析

2.1 冷冻时间对肌原纤维蛋白中残余脂肪氧化的影响

如图1所示，在原料猪肉冻藏0~12周的时间中，肌原纤维蛋白中残余脂肪的TBARS值呈现上升趋势。在冻藏1周时，与新鲜的猪肉相比，肌原纤维蛋白中残余脂肪的 TBARS值未见显著变化（p>0.05），其TBARS值为0.07 mg/kg蛋白。冻藏4周时，脂肪的TBARS值为0.17 mg/kg蛋白。随冻藏时间的持续增加（12周），TBARS值增至0.22 mg/kg蛋白（p<0.05）。因此，随原料肉冻藏时间延长，肌内脂肪的氧化程度不断加剧。赵钜阳等[4]认为生猪肉TBARS升高主要是由于冻藏期间肉中水分缓慢升华，使得水分原来的空间更易被氧气所占据，导致原料肉氧化，TBARS升高。Igene等[11]对冻藏的鸡胸肉中丙二醛的浓度进行测定，结果发现鸡肉在冻藏后期，丙二醛的浓度显著升高，因此，冻藏期间丙二醛浓度增大很可能是导致本研究中TBARS值升高的原因，这与Vivien等[12]的研究结果基本一致。

2.2 冷冻时间对肌原纤维蛋白凝胶保水性的影响

如图2所示，随冻藏时间的延长，肌原纤维蛋白凝胶的保水性显著下降（p<0.05）。与新鲜原料肉相比（46.67%），经 4周冻藏之后，其凝胶保水性降至36.60%（p<0.05）。随冷冻时间的持续增加（12周），肌原纤维蛋白的凝胶保水性降至 33.57%（p<0.05）。原料肉在冷冻的过程中，肌原纤维蛋白不可避免地将会发生氧化[3]。贾娜等[9]研究显示：氧化后的肌原纤维蛋白，其三维立体网络结构遭到破坏，导致肌原纤维蛋白束水力和凝胶网格结构的致密型有所降低，保水性下降。因此，冻藏过程中肌原纤维蛋白的氧化可能是导致其凝胶保水性降低的原因之一。

2.3 冷冻时间对肌原纤维蛋白溶解度的影响

如图3所示，随冻藏时间的延长，原料肉中肌原纤维蛋白的溶解度呈显著下降趋势（由56.08%下降到35.92%）。与新鲜肉中的肌原纤维蛋白相比，经 1周冻藏之后，肌原纤维蛋白的溶解度有所下降，但不显著（p>0.05），且冻藏1周时的肌原纤维蛋白的溶解度是 49.68%。随冻藏时间增加（8周），肌原纤维蛋白的溶解度降至 37.20%（p<0.05）。Sompongse等[13]对冻藏期间肌原纤维蛋白的稳定性进行研究，结果提示冻藏过程中肌原纤维蛋白中的巯基会氧化成二硫键，导致肌原纤维蛋白的重链发生一定程度的聚合，致使溶解度下降。此外，溶解度下降的另一个原因可能是在冻藏过程中肌原纤维蛋白发生氧化[3]，导致原先隐藏的疏水基团发生暴露，进而诱导了疏水相互作用的发生，使得原料肉中肌原纤维蛋白的溶解度下降[8]。

2.4 冷冻时间对肌原纤维蛋白凝胶强度的影响

如图4所示，随着冻藏时间的延长，肌原纤维蛋白的凝胶强度整体呈下降趋势。与新鲜原料肉相比较，经8周冻藏后，肌原纤维蛋白的凝胶强度由0.25降低至0.14（p<0.05）。原料肉在低温冻藏过程中，脂肪和肌原纤维蛋白将会发生氧化，导致肌原纤维蛋白的构象发生变化，使得肌原纤维蛋白分子间的作用力和氢键作用被削弱，导致热诱导后所生成的凝胶网状结构不致密，保水性下降，从而致使肌原纤维蛋白凝胶强度下降[14]。此外，冻藏过程中氧化所导致的肌原纤维蛋白溶解度下降，促使参与成胶的蛋白量减少，可能也是导致肌原纤维蛋白凝胶强度下降的原因[15]。

2.5 冷冻时间对肌原纤维蛋白凝胶白度的影响

从图5中得知，随冻藏时间延长，肌原纤维蛋白的凝胶白度值整体呈下降趋势。与新鲜原料肉相比，经12周冻藏后，肌原纤维蛋白的白度值由59.71降至26.53（p<0.05）。Xia等[16]研究显示脂肪氧化将会导致过氧自由基含量的增加，从而诱发蛋白质氧化，形成的氧化产物与氨基酸侧链发生非酶促反应，导致肌原纤维蛋白的白度值下降。因此，冻藏期间肌内脂肪以及肌原纤维蛋白的氧化将会导致凝胶白度的下降。此外，脂肪氧化所引起的肌原纤维蛋白与色素蛋白发生交联也可能是凝胶白度下降的原因之一[17]。

2.6 相关性分析

由表1可知，冻藏时间与TBARS呈极显著正相关（p<0.01），与溶解度、凝胶保水性、凝胶白度以及凝胶强度呈极显著负相关（p<0.01），由此推断冻藏时间对TBARS、溶解度、凝胶保水性、凝胶白度及强度有较大影响。TBARS与溶解度、凝胶保水性、凝胶白度及凝胶强度呈极显著负相关（p<0.01）；溶解度与凝胶保水性和凝胶白度呈极显著正相关（p<0.01），与凝胶强度呈显著正相关（p<0.05）；凝胶保水性与凝胶白度和强度呈极显著正相关（p<0.01）；凝胶白度与凝胶强度呈极显著正相关（p<0.01）。这个结果进一步表明：冻藏时间对原料肉肌内脂肪和肌原纤维蛋白的凝胶性能影响较大。

表1 猪肉中理化性质的相关性分析Table 1 Correlation analysis of physical and chemical properties in pork

冻藏时间对猪肌内脂肪和肌原纤维蛋白的凝胶性能影响也可用各指标之间的LDA分析来评估。通常，从原点开始，通过与测量指标之间形成向量，两个向量之间的相关性可通过它们之间夹角的余弦值来确定[18]。如图6所示，在TBARS与溶解度、凝胶保水性、凝胶白度以及凝胶强度之间都为钝角矢量角，这表明这些指标之间呈现负相关，说明随肌内脂肪氧化程度的加剧，肌原纤维蛋白的溶解度、凝胶保水性、凝胶白度以及凝胶强度都显著下降。凝胶保水性、溶解度、凝胶白度以及凝胶强度之间呈锐角矢量角，这个结果表明这些指标之间呈现正相关。因此，肌原纤维蛋白溶解度的下降可能也是导致凝胶保水性、凝胶白度和凝胶强度下降的原因。

3 结论

试验主要研究了冷冻时间对猪肌内脂肪氧化及肌原纤维蛋白凝胶性能的影响。结果表明：随冻藏时间的增加，肌内脂肪氧化程度增加，肌原纤维蛋白的溶解度、凝胶保水性、凝胶白度以及凝胶强度均呈下降趋势。这些指标之间的相关性及LDA分析结果表明：冻藏所导致的肌内脂肪氧化可能是肌原纤维蛋白溶解度、保水性、凝胶白度及凝胶强度下降的原因之一。因此，在原料肉低温冻藏过程中，控制肌内脂肪氧化对保证原料肉的品质尤为重要。