结合网络药理学探讨扶正化瘀方对肺纤维化小鼠PI3K-Akt信号通路的影响

景菲，胡旭东，彭渊，邢枫，陶艳艳，刘成海，3

1.上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203；2.上海中医药大学基础医学院，上海 201203；3.上海市中医临床重点实验室，上海 201203

肺纤维化病因复杂，是多种肺疾病的共同结局，中位生存时间仅3～8年，严重影响患者存活率及生活质量。近年来，我国肺纤维化患者数量呈明显增多趋势，中医治疗该病取得了一定成效。目前尚无治疗肺纤维化的特效药物，临床治疗的主要目标是减轻症状、延缓疾病进展和提高生活质量。

扶正化瘀方由丹参、冬虫夏草、绞股蓝、桃仁、松花粉、五味子组成，适用于瘀血阻络、肝肾不足者，临床常用于肝纤维化的治疗。本课题组前期研究表明，扶正化瘀方可减轻博来霉素诱导肺纤维化模型大鼠的肺间质炎症和纤维化，临床观察发现其可明显改善慢性阻塞性肺疾病患者的肺功能，但该方治疗肺纤维化的作用机制尚不清楚。因此，本研究运用网络药理学分析和小鼠肺纤维化实验验证相结合的方法，探讨扶正化瘀方治疗肺纤维化的潜在关键靶点和信号通路。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分筛选及靶点预测

利用中药系统药理学数据库与分析平台（https://www.tcmsp-e.com/，TCMSP）检索扶正化瘀方组方药物丹参、桃仁、冬虫夏草、北五味子、绞股蓝、松花粉的化学成分，以口服利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18为条件进行筛选，获得活性化合物及其作用的蛋白靶点，并根据文献报道补充未预测到的活性化合物的已知靶点。

1.2 疾病相关基因筛选

以“pulmonary fibrosis”“fibrosing alveolitis”“idiopathic pulmonary fibrosis”为关键词，检索GeneCards（ https://www.genecards.org）、 OMIM（http://www.omim.org）数据库，获取肺纤维化的疾病相关基因。

1.3 蛋白相互作用网络构建及核心靶点筛选

通过STRING平台（https://string-db.org）将扶正化瘀方相关靶点蛋白名转换成基因名，再与肺纤维化疾病靶点基因集合取交集，获得交集基因。将交集基因所对应的蛋白通过STRING平台进行蛋白相互作用（PPI）分析，将生物种类设定为“homo sapiens”，最小相互作用阈值设定为“highest confidence”（＞0.9），其余均为默认设置，得到PPI网络及数据；将PPI数据导入 Cytoscape3.8.0软件，运用 Network Analyze工具分析网络拓扑参数，靶点蛋白的节点度（degree）越大其在PPI网络中越重要。

1.4 KEGG通路富集分析

利用 R 语言的“colorspace”“stringi”“ggplot2”“clusterProfiler”“enrichplot”“org.Hs.EG.db”数据包对扶正化瘀方治疗肺纤维化的潜在核心作用靶点进行KEGG通路富集分析，设定显著性为＜0.05。

1.5 动物实验验证

1.5.1 动物及药物

C57BL/6小鼠46只，雄性，SPF级，体质量（24±2）g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK（浙）2019-0001。于独立通气笼中适应性喂养3 d，自由进食饮水。本实验已获得上海中医药大学实验动物福利伦理委员会批准（PZSHUTCM200821006）。

扶正化瘀方干膏粉，上海现代中医药股份有限公司，批号200414；甲泼尼龙片，Pfizer Italia Srl公司，批号DL2665。

1.5.2 主要试剂与仪器

硫酸博来霉素（批号CSN10472），美国Csnpharm公司；生理盐水（批号W180403G1），青岛华仁药业股份有限公司；Masson三色染色液（批号ab150686），英国Abcam公司；HE染色试剂盒（批号10004160），南京建成生物工程研究所有限公司；总RNA抽提试剂盒（货号 B511321）、反转录试剂盒 PrimescriptRTreagent Kit with gDNA Eraser（货号 RR047A）、TBGreenPremix EX Taq扩增试剂盒（货号RR420A），日本TaKaRa公司。

小动物喉镜、液体定量雾化器（上海伯建生物科技有限公司），3-18KS型高速冷冻离心机（德国Sigma公司），BSA3202SCW型电子天平（德国Sartorius公司），BX51型显微镜及图像分析系统（日本Olympus公司），ASP300全自动组织脱水机（德国徕卡公司），EG1140石蜡包埋机（德国徕卡公司），Leica RM2235石蜡切片机（德国徕卡公司），HI1210展片机（德国徕卡公司），HI1220烤片机（德国徕卡公司）。

1.5.3 模型制备及给药

采用随机数字表法将 46只小鼠分为正常对照组10只、模型组12只、扶正化瘀组12只、甲泼尼龙组12只。除正常对照组外，其余组小鼠应用小动物喉镜及液体定量雾化器进行一次性气管内雾化喷入博来霉素2 mg/kg。正常对照组气管内雾化等体积生理盐水。造模次日起，扶正化瘀组和甲泼尼龙组分别灌胃扶正化瘀干膏粉（5.6 g/kg）、甲泼尼龙（10 mg/kg），每日1次。至第21日，以戊巴比妥钠麻醉小鼠，打开胸腔，一侧肺组织浸入福尔马林中固定，另一侧肺组织先置于液氮中，后放于-80 ℃冰箱冷冻保存。各组随机选取5只小鼠肺组织进行qRT-PCR检测。

1.5.4 肺组织病理学观察

取经福尔马林固定的肺组织，常规石蜡包埋，切片，贴附于载玻片上，脱蜡至水，酒精梯度脱水，采用HE染色试剂盒进行HE染色，采用Masson三色染色液进行Masson染色，中性树胶封片，于显微镜下观察并拍片。

1.5.5 qRT-PCR检测肺组织PI3K、AKT1、NF-κB、CASP9、Bcl2基因表达

肺组织匀浆后，使用总RNA提取试剂盒提取组织总 RNA，使用反转录试剂盒将 RNA反转录为cDNA，按试剂盒说明书操作。使用 Primier5.0软件设计检测基因的引物（见表1），使用SYBR Green嵌合荧光法于Roche480机器进行qRT-PCR。

表1 各基因qRT-PCR引物序列

1.5.6 统计学方法

2 结果

2.1 扶正化瘀方活性成分及相应靶点

经TCMSP检索并筛选，分别得到丹参、桃仁、冬虫夏草、北五味子、绞股蓝、松花粉的活性成分65、23、7、8、24、2个，相应靶点 135、53、71、21、164、62个，去除重复后共得到125个化学成分、221个靶点基因。

2.2 肺纤维化疾病靶点

通过GeneCards和OMIM数据库检索，分别获得“pulmonary fibrosis”“fibrosing alveolitis”“idiopathic pulmonary fibrosis”相关基因5 492、256、3 236个，合并去除重复基因，共获得肺纤维化疾病靶点基因5 897个。

2.3 潜在核心靶点生物信息学分析

对扶正化瘀方靶点基因和肺纤维化疾病靶点基因取交集，获得扶正化瘀方治疗肺纤维化的潜在靶点基因191个。利用STRING平台对交集基因对应的蛋白进行PPI分析，扶正化瘀方治疗肺纤维化靶点蛋白PPI网络见图1。利用Cytoscape3.8.0软件分析网络拓扑参数，节点度排序前30位的核心靶点见图2。其中AKT1居首位，提示AKT1可能是扶正化瘀方治疗肺纤维化最关键蛋白。

图1 扶正化瘀方治疗肺纤维化靶点蛋白PPI网络

图2 扶正化瘀方治疗肺纤维化的关键靶点

2.4 核心靶点KEGG通路富集分析

核心靶点KEGG通路富集分析显示，AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、C型凝集素受体信号通路等是扶正化瘀方治疗肺纤维化的潜在信号通路（见图3、表2）。

图3 扶正化瘀方治疗肺纤维化核心靶点KEGG通路

表2 扶正化瘀方治疗肺纤维化核心靶点KEGG通路富集分析结果

结合PPI网络分析和KEGG通路富集分析结果，扶正化瘀方可能通过调控 PI3K-Akt信号通路及通路中的AKT1、NF-κB、CASP9、Bcl2等基因表达发挥抗肺纤维化作用（见图4）。

图4 扶正化瘀方治疗肺纤维化的PI3K-Akt信号通路

2.5 扶正化瘀方对模型小鼠肺组织形态的影响

正常对照组小鼠肺组织结构正常，部分肺间隔轻度增厚，间质可见少量慢性炎症细胞浸润；模型组小鼠可见巨噬细胞、淋巴细胞等浸润，肺泡壁增厚及肺泡间隔增宽，在肺间质区域内可见成纤维细胞聚集和胶原基质沉积增加，肺实质结构紊乱；与模型组比较，扶正化瘀组和甲泼尼龙组小鼠肺泡壁增厚、炎症细胞浸润情况有所缓解。见图5。

2.6 扶正化瘀方对模型小鼠肺组织纤维化的影响

正常对照组小鼠肺泡结构正常，间质未见纤维组织增生；模型组小鼠肺泡间隔增厚，肺泡塌陷萎缩，可见大量胶原纤维沉积；与模型组比较，扶正化瘀组与甲泼尼龙组小鼠纤维组织增生有所减轻。见图6。

图6 各组小鼠肺组织形态（Masson染色，×100）

2.7 扶正化瘀方对模型小鼠肺组织PI3K-Akt信号通路相关基因表达的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠肺组织 PI3K、AKT1、NF-κB、CASP9、Bcl2基因表达均明显升高；与模型组比较，扶正化瘀组和甲泼尼龙组上述基因表达均显著降低。见表3。

表3 PI3K-Akt信号通路相关基因mRNA相对表达量各组比较（±s）

3 讨论

纤维化是肺脏损伤后过度修复的病理过程，早期主要表现为肺泡炎症，后期可发展为大量成纤维细胞异常增殖和细胞外基质大量沉积。其发病机制主要与机体免疫失调及炎症有关。肺纤维化属中医学“肺痿”“肺痹”等范畴，可从“虚、瘀、痰、毒”角度进行阐述，为本虚标实之证，本虚以气虚为主，标实以血瘀为重。虽然肺纤维化的病因病机复杂多变，但气虚血瘀贯穿整个病程，故应以扶正化瘀通络为基本治法，虚实、标本同治。扶正化瘀方原用于治疗肝纤维化，慢性肝病及肺病均有“正虚血瘀”的病机特点，存在异病同治、补虚化瘀的理论基础及方-证效应的物质基础。研究表明，扶正化瘀方可通过抑制 MMP-2/9蛋白活性减少肺组织的炎症破坏，起到抗大鼠肺纤维化的作用。

本研究采用网络药理学方法分析扶正化瘀方治疗肺纤维化的潜在作用机制。得到扶正化瘀方活性成分125种、相应靶点基因221个，以及肺纤维化疾病相关靶点5 897个，交集基因191个。潜在靶点PPI网络分析显示，扶正化瘀方治疗肺纤维化的最重要靶点为AKT1；KEGG富集分析显示，PI3K-Akt信号通路可能是扶正化瘀方治疗肺纤维化的潜在作用通路。PI3K-Akt信号通路具有调控细胞增殖、转化、凋亡等功能，与肺纤维化关系密切。PI3K是生长因子受体超家族信号转导过程中的重要组成部分，激活后的PI3K可特异性催化磷脂酰肌醇环上的 3位羟基磷酸化，引起下游蛋白磷酸化，促进肺泡上皮细胞发生间充质转化和细胞外基质沉积，从而形成肺纤维化。AKT是PI3K下游的直接靶蛋白，可参与调控细胞增殖及代谢，促进纤维化相关基因转录和蛋白质合成。王晓艳等观察肺泡巨噬细胞株NR8383细胞在染尘处理后的自噬情况，以 LY294002阻断 PI3K途径，发现 PI3K-Akt信号通路参与了矽尘诱导肺泡巨噬细胞的自噬过程。马爱平等发现，肺纤维化组织存在Akt过度活化，活化的Akt激活下游的HIF-1α信号通路，抑制肺泡表面活性物质产生和肺泡上皮细胞的正常修复，从而加重纤维化。核因子-κB（NF-κB）是重要的炎症反应和细胞凋亡调节因子，在PI3K-Akt信号通路中，AKT活化可促进NF-κB激活，启动下游的炎症反应，产生肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6等炎性因子，加重纤维化。细胞凋亡在肺纤维化发病机制中发挥重要作用，CASP9和Bcl2均是PI3K-Akt信号通路的下游靶蛋白，当细胞受到凋亡信号刺激时，会刺激线粒体释放细胞色素 C及凋亡小体，引起Caspases家族发生级联反应，其中Caspase-9是细胞凋亡的激活剂。此外，孙晓芳等发现，调节 Bax/Bcl2蛋白和基因表达可抑制肺组织气道上皮细胞凋亡，从而抑制小鼠肺纤维化的发展。

本研究结果显示，扶正化瘀方可明显减轻博来霉素诱导的小鼠肺损伤和肺纤维化，并显著降低PI3K、AKT1、NF-κB、CASP9、Bcl2基因表达水平，推测扶正化瘀方可能通过调控 PI3K-Akt信号通路中相关基因的表达抑制肺组织炎症反应和细胞凋亡，从而发挥抗肺纤维化作用。

综上所述，本研究运用网络药理学方法分析扶正化瘀方治疗肺纤维化的潜在关键靶点和信号通路，并利用动物实验进行了初步验证，结果表明 PI3K-Akt信号通路可能是扶正化瘀方抗肺纤维化的关键信号通路，其具体机制尚待进一步研究。