涡旋辅助离子液体双水相萃取五味子中木脂素类化合物

李琼婕，赵 哲，王秀娟，毕金龙，王志兵

（长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春 130012）

五味子为木兰科植物五味子（Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.）的干燥成熟果实[1]，是一种闻名中外的中药，常用于治疗慢性咳喘、遗精、遗尿、久泻、自汗口渴及肝炎、糖尿病、高血压、失眠和肾气不足等[2-4]。据报道，五味子中的化学成分包括多糖、木脂素、氨基酸和挥发油等，其中木脂素是其主要活性成分，如五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素等，这些成分具有抗肿瘤、肝保护和抗氧化、抗HIV等作用[5-6]。

目前，用于木脂素类化合物检测的常用方法有紫外分光光度法[7]、高效液相色谱法[8-9]、高效液相色谱-质谱联用法[10-11]、超高液相色谱法[12-13]等。其中，高效液相色谱法因其灵敏度高、分析速度快、成本低而被广泛应用于中药中木脂素类化合物的检测分析[14]。但由于中药中的基质组成非常复杂，所以在检测之前需要对样品进行前处理。常用的木脂素类化合物的前处理方法有回流法[15]、超声波提取法[16-18]、微波提取法[19-20]、超临界流体提取法[16,21]等。如王茹等[22]、裴毅等[23]、Zhu等[24]建立的方法，虽然提取量高、工艺稳定，但同时也面临着有机溶剂用量大、耗时长、设备成本高等问题。近几年，一些新的木脂素类化合物提取方法出现，如Cheng等[25]提出的粉碎组织提取法，Zhang等[26]建立的一种基质固相分散法结合高效液相色谱法，与传统方法相比，不仅提取量较高且对样品、溶剂和时间的要求降低。为了解决萃取时间长、样品用量大、设备昂贵、操作繁琐等问题，双水相体系（Aqueous two-phase system，ATPs）作为一种新型的液-液萃取技术逐渐引起人们的关注[27]。与传统的液-液萃取技术相比，其萃取原理相似，都是根据物质在两相间的分配系数的不同来进行分离。Shoushtari等[28]与Da等[29]提出的乙腈/碳水化合物双水相体系和聚乙二醇-柠檬酸双水相体系，实验结果较为满意，但前者使用了可挥发性有机溶剂，危害环境，后者虽然该体系所用试剂环保，但分相时间长。因此为了改进传统双水相的不足，研究人员开始用离子液体（ionic liquid, IL）代替传统有机溶剂。IL是由有机阳离子和无机或有机阴离子结合而成的有机熔盐[30]。基于离子液体的双水相体系解决了分相速度慢的问题，其乳液形成少，不含挥发性有机溶剂，具有分相时间短、不易乳化、稳定性高、易回收等优点，现已成功用于分离药物、蛋白质、激素和抗生素等化合物[31]。然而，到目前为止，尚未发现采用离子液体/盐双水相体系萃取五味子中的木脂素类化合物的相关报道。

因此，本研究首次建立[C4mim]BF4/MgSO4双水相体系，并用于五味子中木脂素类化合物的提取，对萃取条件进行了优化，并进行了方法学考察。为了评价本法性能，本研究将其与热回流法和超声提取法进行了比较。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

五味子药材 购买于当地药房（中国，长春），粉碎后过80目筛，并于60 ℃烘箱中干燥至恒重，储存于干燥器中备用；五味子醇甲（Schizandrol A）、五味子酯甲（Schizandrol A）、五味子甲素（Schisandrin A）和五味子乙素（Schizandrin B）标准品（纯度大于99%） 上海市阿拉丁试剂有限公司；戈米辛D（Gomisin D）、五味子酚（Schisanhenol）、五味子丙素（Schisandrin）和五味子醇乙（Schizandrol B）标准品（纯度大于99%） 成都曼斯生物科技有限公司；1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[C2mim]BF4）、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[C4mim]BF4）、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸（[C6mim]BF4）、1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸（[C8mim]BF4） 上海成捷化学有限公司；MgSO4、K2CO3、Na2CO3、K2HPO4、KCl、NaCl 北京化工厂；甲醇（色谱级） 美国Fisher公司；其他试剂均为分析纯。

Agilent TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、安捷伦1100型液相色谱仪（配有二极管阵列检测器） 美国安捷伦公司；Centrifuge 5430R型高速离心机 德国艾本德股份公司；XW-80型旋涡混合器上海青浦泸西仪器厂；KQ5200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；FW177型中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 标准溶液的配制

精确称量各标准品10 mg于10 mL容量瓶内，用适量甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度1000 μg·mL-1的标准储备液，于4 ℃下避光保存，其他工作液均由标准储备液经甲醇稀释得到。

1.3 萃取方法

1.3.1 离子液体/盐双水相萃取 双水相萃取（Aqueous two-phase extraction，ATPE）实验流程如图1所示，精确称取10 mg五味子粉末样品于10 mL离心管中，向其加入4 mL水和500 μL的[C4mim]BF4，手动振摇30 s后加入1.6 g MgSO4，涡旋混合1.5 min后，在3000 r/min下离心10 min后，得到液-固-液三相体系。其中，上相为离子液体相，中相为五味子残渣，下相为水相。随后，将上相全部取出，用甲醇稀释至0.5 mL，过0.22 μm滤膜后进行色谱分析。

图1 涡旋辅助离子液体双水相萃取流程图Fig.1 Procedure of votex-assisted ionic liquid aqueous two-phase extraction

1.3.2 热回流提取法（Hot reflux extraction, HRE）参考王茹等[23]的研究方法。精确称取0.5 g五味子样品于圆底烧瓶内，加入95%乙醇15 mL，称重，加热回流提取2 h，冷却至室温后称重，用95%乙醇补齐损失的重量，摇匀后过滤，取续滤液2 mL，减压干燥后用2 mL甲醇回溶，过0.22 μm滤膜后进行色谱分析。

1.3.3 超声波提取法（Ultrasonic extraction, UE） 根据《中国药典》（2020版）[1]，精确称取0.25 g五味子样品粉末于20 mL容量瓶内，加入甲醇约18 mL，以功率200 W的超声条件超声20 min，冷却至室温后定容至刻度，摇匀过滤，取续滤液2 mL过0.22 μm滤膜后进行色谱分析。

1.4 相图的绘制

相图的绘制采用浊点滴定法[32]，用数字恒温加热套保持温度为（25±2）℃，各组分浓度以质量体积比表示。操作过程如下：吸取2 mL（m1）的0.5 g·mL-1[C4mim]BF4水溶液置于比色管中，向其逐滴滴加0.5 g·mL-1MgSO4水溶液至体系混浊，记录加入量（m2），再逐滴滴加水至澄清，记录水的加入量（m3），直至不再出现浑浊，计算每个浊点时[C4mim]BF4和MgSO4的质量体积比浓度，分别记为w1和w2，计算如下。

准确移取2 mL（m1）的0.5 g·mL-1[C4mim]BF4水溶液置于另一个比色管中，向其中滴加0.2 g·mL-1Na2CO3水溶液至体系混浊，记录加入量（m2），再逐滴滴加水至澄清，记录水的加入量（m3），直至不再出现浑浊，计算每个浊点时[C4mim]BF4和Na2CO3的质量体积比浓度，分别记为w1和w2，计算如下，以w1、w2为横纵坐标作图，即得双节线图。

IL质量分数：

成相盐质量分数：

1.5 萃取条件优化

1.5.1 离子液体（IL）的种类与体积 按照1.4离子液体/盐双水相萃取法，在MgSO4的用量为1.2 g，涡旋时间为2 min，离心转速与时间为3000 r/min，10 min的前提下，考察不同体积（250～550 μL）的四种离子液体（[C2mim]BF4、[C4mim]BF4、[C6mim]BF4和[C8mim]BF4）对五味子提取量的影响。

1.5.2 盐的种类与用量 按照1.4离子液体/盐双水相萃取法，IL的种类与体积为1.5.1的最佳条件，涡旋时间为2 min，离心转速与时间为3000 r/min，10 min的前提下考察不同用量（1.1～1.7 g）的两种盐（MgSO4和Na2CO3）对五味子提取量的影响。

1.5.3 涡旋时间 按照1.4离子液体/盐双水相萃取法，盐的种类与用量为1.5.2的最佳条件，离心转速与时间为3000 r/min，10 min的前提下考察涡旋时间（0.5～5 min）对五味子提取量的影响。

1.5.4 离心转速及时间 按1.3.1离子液体/盐双水相萃取法，涡旋时间为1.5.3的最佳条件下考察不同离心转速（1000～6000 r/min）和离心时间（2～30 min）对五味子提取量的影响。

1.6 色谱分析

色谱条件如下：流动相由甲醇（A）和水（B）组成，洗脱梯度条件如下所示：0～10 min，68% A；10～15 min，68%～80% A；15～40 min，80% A；40～42 min，80%～68% A；42～45 min，68% A；流动相流速为0.5 mL·min-1；进样量为10 μL；柱温为35 ℃；检测波长为254 nm。色谱柱为Agilent TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

本研究以保留时间进行定性，五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素的保留时间分别为15.556、17.658、20.658、26.41、29.856、36.319、42.087 min。取1000 μg·mL-1的各标准储备液配制成各浓度为200、70、70、60、20、50、10 μg·mL-1的混合标准溶液，分别取1.95、3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125、250、500、1000 μL混合标准溶液于2 mL容量瓶内用甲醇定容至刻度，制得一系列浓度的混合标准溶液。在上述色谱条件如下进行分析，以浓度（c）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线。通过标准曲线对目标物进行定量。

1.7 数据处理

提取量及回收率的计算分别见公式（3）、（4）。所有实验数据均用Origin 2019软件进行统计分析。

式中：E为提取量，mg·g-1；C为提取物的浓度，mg·mL-1；V为提取物的体积，mL；M为样品质量，g。

式中：R为回收率，%；C0为初始量，mg·g-1；C1为加标量，mg·mL-1；C2为检出量，mg·g-1。

2 结果与分析

2.1 双水相体系相图

[C4mim]BF4与MgSO4和Na2CO3形成的相图如图2所示，双节线下方的区域为均匀的单相，形成双水相的两组分混合后溶液澄清，为均相区；双节线上方的区域，不同的两组分混合后体系能自动分为两相，为双水相区；双节线上的部分，溶液刚好由澄清变为混浊，为刚要分相的区域。[C4mim]BF4/MgSO4双水相的成相范围为：[C4mim]BF421.28%～78.43%，MgSO45.88%～37.70%，水15.69%～45.38%。[C4mim]BF4/Na2CO3双水相的成相范围为：[C4mim]BF422.10%～83.33%，Na2CO34.17%～30.39%，水12.50%～50.71%。

图2 [C4mim]BF4/MgSO4和[C4mim]BF4/NaCO3相图Fig.2 Phase diagrams of the [C4mim]BF4/MgSO4 and[C4mim]BF4/Na2CO3

图2显示了[C4mim]BF4与MgSO4和Na2CO3体系在298 K下测定的二项式曲线，该曲线提供了有关形成双相体系的各相组分浓度的信息。从图中可以看出，向离子液体的水溶液中加入正确浓度的MgSO4或Na2CO3，形成了ATPs。众所周知，二项式曲线越接近原点，成相能力越强[33]。通过绘制[C4mim]BF4/MgSO4和[C4mim]BF4/Na2CO3的相图发现[C4mim]BF4/Na2CO3的成相能力优于前者，但试验结果表明[C4mim]BF4/MgSO4体系对木脂素类化合物的提取量更高。这表明对于双水相体系组成的选择，成相能力不是第一评价标准。

2.2 萃取条件优化

2.2.1 离子液体（IL）的种类和体积 离子液体/盐双水相由离子液体、盐和水三部分组成，在本研究中，离子液体作为萃取溶剂，其结构和理化性质对双水相成相和萃取效果有重要影响。因此，本研究考察了4种离子液体[C2mim]BF4、[C4mim]BF4、[C6mim]BF4和[C8mim]BF4对目标物回收率的影响。实验结果表明，[C2mim]BF4和[C8mim]BF4不能形成双水相体系，其主要原因是[C2mim]BF4有较强水溶性，加盐后始终为均相溶液，而[C8mim]BF4由于其较强的疏水性，加入到水溶液时不溶，直接沉于试管底部。[C4mim]BF4和[C6mim]BF4可与盐形成双水相体系，且[C4mim]BF4形成的双水相效果最好。据文献报道，离子液体咪唑环上的烷基链越长，其疏水性越强，对水的斥力越大，形成双水相的能力就越强[34-37]。虽然[C6mim]BF4疏水性强于[C4mim]BF4，疏水性增强，但黏性也更强，不利用双水相萃取。因此，本研究选用[C4mim]BF4进行后续的实验。

本研究考察了当水为4 mL，MgSO4用量为1.6 g时，离子液体用量（250～550 μL）对木脂素类化合物提取量的影响。如图3所示，随着离子液体用量从250 μL增加至500 μL，木脂素类化合物的提取量明显提高，五味子醇甲提取量由3.42 mg·g-1提高至5.26 mg·g-1，各化合物提取量提高近50%。然而，继续增加离子液体用量，目标物提取量几乎不变或略有下降。这可能是由于离子液体具有一定粘度，其用量增加，尽管能有效提取目标物，但同时也增加了体系的粘度，不利于传质。因此，本研究选择离子液体用量为500 μL。

图3 IL体积对提取量的影响Fig.3 Effect of the volume of IL on the extraction yield

2.2.2 盐的种类及用量 无机盐的加入会影响离子液体在双水相体系中的分布，同时也会改变目标组分的分配系数和提取效率[38]。因此，本研究考察了[C4mim]BF4分别与硫酸镁、碳酸钾、碳酸钠、磷酸氢二钾、氯化钾和氯化钠的成相效果。实验结果表明，当水为4 mL，离子液体体积为500 μL时，MgSO4和Na2CO3可以与[C4mim]BF4形成双水相，这可能是因为偏渗透性离子CO32-、SO42-与水分子的相互作用更强，有利于双水相的形成[39]。如图4所示，MgSO4所形成的双水相体系的提取量明显高于Na2CO3，这可能是因为Mg2+的原子半径更大，电荷也更高，导致了这种现象的发生[40]。因此，本研究选用MgSO4作为成相盐。

图4 盐的种类对提取量的影响Fig.4 Effect of type of salt on the extraction yield

此外，本研究还考察了MgSO4用量为1.1～1.7 g时对目标物提取量的影响。如图5所示，随盐用量的增加，离子液体相体积不断增加，目标物提取量随之增加，这可能是因为随着盐用量的增加，MgSO4的盐析作用占主导地位，IL逐渐与水分离且目标物随着IL相富集到上相[41]。当MgSO4用量为1.6 g时，提取量最高，此时上相（IL相）体积为450 μL，继续增加盐的用量，目标物提取量略有下降，这可能是因为成相盐的过量使用使粘度增加，不利于目标分析物的转移[42]，从而导致提取量降低。因此，本研究选择MgSO4的用量为1.6 g。

图5 盐的用量对提取量的影响Fig.5 Effect of amount of salt on the extraction yield

2.2.3 涡旋时间 在萃取时，涡旋可以加速乳状液的形成，增加萃取剂与目标物质的接触面积，加速传质并缩短萃取平衡时间[43]。本研究考察了涡旋时间（0.5～5 min）对五味子中木脂素类化合物提取量的影响。实验结果如图6所示，在涡旋1.5 min时提取量最高，总木脂素类化合物提取量为9.82 mg·g-1，尽管涡旋时间对目标物提取量影响较小，但如不对样品溶液进行涡旋时，[C4mim]BF4/MgSO4体系分相耗时长。然而，在对该体系进行涡旋后无需静置，即可分相。为了加速传质过程，缩短提取时间，本研究选择涡旋1.5 min作为后续实验条件。

图6 涡旋时间对提取量的影响Fig.6 Effect of vortex time on the extraction yield

2.2.4 离心转速及时间 离心能促进双水相体系的形成，使相与相之间的分层更加清晰，便于离子液体相的转移。因此，本研究考察了1000～5000 r·min-1范围内离心转速对目标物提取量的影响。如图7所示，随着离心转速的增加，木脂素类化合物的提取量逐渐提高，当离心转速为3000 r·min-1时，提取量达到最大值。

图7 离心转速对提取量的影响Fig.7 Effect of centrifugation speed on the extraction yield

此外，本研究还考察了不同离心时间（2～30 min）对提取量的影响。如图8所示，在离心10 min后，双水相分层清晰且木脂素类化合物的提取量达到最大值，体系达到萃取平衡，提取量不再上升。在离心之后，目标物被富集于上相，下相为水相，中间相为五味子残渣。此时相界面清晰，便于上相全部取出。因此，本研究选择在3000 r/min，离心10 min为最佳离心条件。

图8 离心时间对提取量的影响Fig.8 Effect of centrifugation time on the extraction yield

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系、检出限、定量限和精密度 配制含有7种木脂素类化合物的一系列浓度的混合标准品溶液，以目标物质的浓度（c）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线。检出限（LOD）和定量限（LOQ）为信噪比（S/N）分别为3和10时仪器能检出和定量目标物质的最低浓度。日内、日间精密度以相对标准偏差（RSD）表示，在最佳实验条件下，一天内连续分析6次样品所得的目标物提取量的RSD为日内精密度；每天分析2次、连续分析3 d样品所得目标物提取量的RSD为日间精密度。实验结果如表1所示，各目标分析物在线性范围内具有良好的线性关系（r＞0.9995），LOD和LOQ分别为0.20～6.98和0.65～23.26 ng·mL-1，日内精密度RSD低于3.97%，日间精密度RSD低于4.19%，方法性能满足要求。

表1 线性回归方程、检出限（LOD）、定量限（LOQ）及精密度Table 1 Linear regression equation, LOD, LOQ and precision

2.3.2 加标回收率及实际样品分析 为了确定本研究的准确性和适用性，本研究分别进行了加标回收率与实际样品分析试验。加标回收率如表2所示，各目标物质的回收率为72.22%～97.19%，RSD低于3.97%，实验结果令人满意，因此本研究建立的方法可用于其他中药中木脂素类化合物的提取。

表2 化合物的回收率Table 2 Recovery of chemical compounds

本研究对7种不同产地的五味子样品进行分析，分别来自辽宁（样品1）、浙江（样品2）、黑龙江（样品3）、陕西（样品4）、甘肃（样品5）、内蒙古（样品6）和吉林（样品7）。实验结果如表3所示，所有产地北五味子样品中，各目标分析物中均以五味子醇甲的含量最高，是中药五味子的标志性成分，这与中国药典的报道相一致。从表3可以看出，五味子醇甲的含量为0.08～5.33 mg·g-1，戈米辛D的含量为0.04～0.34 mg·g-1，五味子醇乙的含量为0.07～1.98 mg·g-1，五味子酚的含量为0.12～0.91 mg·g-1，五味子甲素的含量为0.30～1.07 mg·g-1，五味子乙素的含量为0.05～1.47 mg·g-1，五味子丙素的含量为0.03～0.18 mg·g-1。各产地的五味子中木脂素类化合物的含量不同，原因可能是各地药材的生长环境、光照条件、雨水条件及采收时间均不同。东北五味子的五味子醇甲的含量明显高于其他产地，与其他文献中报道的一致，亦与中药道地药材的标准一致[44]。五味子标准溶液与样品提取物色谱图如图9所示。

图9 五味子标准品与样品提取物色谱图（a）和（b）及光谱图（c）和（d）Fig.9 Chromatograms （a）, （b） and spectrogram （c）, （d） of the Schisandra chinensis standard solution and sample extracts

表3 实际样品分析（n=3）Table 3 Actual sample analysis(n=3)

2.3.3 方法比较 为了评价本研究所建立的方法的实用性，将其与超声提取法、热回流法进行比较，实验结果如表4所示。与其他方法相比，本法无需过滤、浓缩等步骤，简化了操作流程。与热回流相比，本法将提取时间从120 min缩短至12 min，大大减少了实验时间，且不用加热，操作简单。综上所述，本法具有操作简单、用时短、提取量高等优点。

表4 方法比较Table 4 Methed comparison

3 结论

本实验建立了一种简单、高效、绿色的涡旋辅助离子液体双水相法萃取五味子中7种木脂素类化合物，结合高效液相色谱法对目标物进行分离和定量。与其他方法相比，本法用离子液体代替传统有机溶剂作为萃取溶剂，由亲水性离子液体[C4mim]BF4和MgSO4组成双水相体系，具有绿色、分相速度快、操作简单、提取量高等优点，可尝试用于其他中药中木脂素类化合物的提取。本实验以亲水性离子液体[C4mim]BF4为萃取溶剂建立的提取方法[C4mim]BF4会残留于木脂素类中且ATPs一次萃取量过少，因此该法仅适用于木脂素类化合物的的分析与检测，不适合用于五味子提取物的制备与工业化生产。为此，在未来将致力于建立一种更加绿色、萃取量大、适合工业化生产的提取方法。