基于CRISPR-Cas13a技术的乙型肝炎病毒cccDNA检测方法临床应用评价*

田原，万妍，徐玲，张向颖，任锋，吴剑

(1.首都医科大学附属北京佑安医院北京肝病研究所，北京100069；2.首都体育学院运动科学与健康学院，北京100191)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染可引发肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌，严重威胁人类的生命健康，给社会造成巨大的经济压力[1]。HBV不能被治愈的关键因素在于共价闭合环状DNA(cccDNA)，它是病毒复制转录的模板[2]。目前HBV cccDNA的检测方法主要有Southern blot、滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)、荧光定量PCR(Real-time PCR, qPCR)和巢式PCR等，均存在灵敏度低、操作繁琐和成本较高等缺点[3-4]。因此，需要建立一种更有效的HBV cccDNA检测方法。

近年来，规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins，CRISPR/Cas)被应用于分子诊断[5]。如Cas13a蛋白具有“附带切割”活性，不仅能在CRISPR RNA(crRNA)的引导下切割靶标核酸，还能切割附近的非靶标核酸[6]。研究人员利用此特性开发了SHERLOCK(specific high sensitivity enzymatic reporter unLOCKing)等检测方法，具有较高的灵敏度[7]。通过本课题组前期的实验研究，笔者利用RCA、PCR和CRISPR/Cas13a技术建立了具有高灵敏度检测HBV cccDNA的方法(命名为CRISPR-HBV cccDNA方法)。本研究拟利用CRISPR-HBV cccDNA、数字PCR(ddPCR)和荧光定量PCR法对HBV cccDNA质粒及临床样本进行检测及对比，进而评价CRISPR-HBV cccDNA方法的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1研究对象 收集2017年6月至2020年10月在首都医科大学附属北京佑安医院就诊的25例HBV感染患者以及5例非HBV感染患者的肝组织样本。纳入标准：血液中检测出HBV DNA。排除标准：无HBV感染史，且血液中未检测出HBV DNA。所有患者均未经过治疗。其中HBV感染患者年龄为(45±15)岁，非HBV感染患者年龄为(39±11)岁。本研究经首都医科大学附属北京佑安医院医学伦理委员会审批[批准文号：京佑科伦字(2020)132号]，患者均签署知情同意书。

1.2试剂与仪器 质粒为本实验室构建的pUC57-HBV质粒。LwCas13a蛋白(杭州众测公司)，RNase抑制剂、T7 RNA聚合酶、rNTP Mix、phi29 DNA聚合酶和HindⅢ内切酶(美国NEB 公司)，质粒保护性ATP依赖的DNA酶Plasmid-safe ATP-dependent DNase(美国Lucigen公司)，DNA产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒和DNA提取试剂盒(北京天根生化科技公司)，TaqMan Fast Advanced Master Mix(美国Applied Biosystems公司)。 ViiATM7 Real-Time PCR System荧光定量PCR(美国Applied Biosystems公司)，新羿TD-1微滴式数字PCR仪(北京新羿公司)，NanoDropTMOne/OneC微量 UV-Vis分光光度计(美国赛默飞公司)。

1.3引物和探针设计 根据HBV cccDNA与HBV松弛环状DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)基因结构上的差异，在跨越HBV DNA负链缺口处的相对保守位置设计引物和探针(表1)，其GenBank序列号为：OM688318.1。RCA引物R1～R8均来自相关文献[8]。所有引物和探针序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物及探针序列

1.4HBV cccDNA阳性质粒的构建 利用HBV cccDNA引物对pUC57-HBV质粒进行扩增，然后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，使用DNA产物纯化试剂盒对目的片段的凝胶进行回收，利用回收的目的片段与T载体连接，转入JM109大肠埃希菌中，再将大肠埃希菌置于LB培养基中，在37 ℃孵箱中过夜并进行扩增，最后利用质粒提取试剂盒进行质粒提取。

1.5肝组织HBV cccDNA的制备 先按照DNA提取试剂盒说明书从肝组织中提取总DNA，然后用HindⅢ内切酶对总DNA进行酶切。HindⅢ酶切体系总体积为50 μL，包括：HindⅢ内切酶1 μL，10× NEB Buffer 5 μL，总DNA 10 μL，DEPC水34 μL。反应条件：37 ℃水浴60 min。用PSAD酶进行消化。PSAD酶切体系总体积为11.7 μL，包括：25 mmol/L ATP 0.8 μL，PSAD(10 U/L)0.4 μL，10× Buffer 2 μL，肝组织DNA产物 8.5 μL。反应条件：37 ℃水浴12 h过夜，70 ℃水浴30 min。收集并得到HBV cccDNA产物。

1.6RCA扩增 第一步扩增体系总体积为10 μL，包括：10× Phi29 DNA聚合酶 Buffer 1 μL，引物(R1～R8)4 μL(每个引物0.5 μL)，HBV cccDNA<5 μL(适量)，DEPC水补足至10 μL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min；50 ℃ 15 s；30 ℃ 15 s；20 ℃ 10 min。第二步扩增体系总体积为20 μL，包括：上一步扩增产物10 μL，Phi29 DNA聚合酶1 μL，10× Phi29 DNA聚合酶 Buffer 1 μL，引物(R1～R8)4 μL(每个引物0.5 μL)，Phi29 BSA 1 μL，4× dNTP mix 3 μL。反应条件：30 ℃水浴16 h过夜， 65 ℃水浴10 min。

1.7逆转录反应及荧光定量PCR检测 逆转录反应体系总体积为20 μL，包括：TaqMan Fast Advanced Master Mix 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，探针0.5 μL，模板2 μL，ddH2O 6.5 μL。反应条件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，共40个循环。根据Ct值判断结果：Ct值≤35为阳性，3540为阴性。

1.8数字PCR检测 根据新羿TD-1微滴式数字PCR仪操作，配置反应体系，总体积为30 μL，包括：2×SuperMix 15 μL，上游引物(10 μmol/L)0.6 μL，下游引物(10 μmol/L)0.6 μL，探针(10 μmol/L)0.6 μL，模板3 μL，ddH2O 10.2 μL。反应条件：95℃ 10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40个循环；12 ℃ 5 min。根据拷贝数判断结果：拷贝数≥1为阳性，拷贝数<1为阴性。

1.9CRISPR-Cas13a检测 配置检测体系，总体积为25 μL,包括：NTP Mix(2.5 mmol/L)2 μL，RNA酶抑制剂1 μL，LwCas13a蛋白(25 nmol/L)1 μL，T7 RNA聚合酶0.5 μL，MgCl2溶液(10 mmol/L)0.25 μL，HEPES缓冲液(20 mmol/L)0.5 μL，crRNA(2 μmol/L)1.5 μL，荧光报告RNA(2 nmol/L)2.5 μL，无菌/无酶ddH2O 10.75 μL，扩增产物5 μL。其中，crRNA靶位点序列为：GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACAACUUUUUCACCUCUGCCUAAUCAUCUC。检测条件：37 ℃ 60 min。检测并判读60 min时的荧光值。

1.10灵敏度比对试验 利用微量 UV-Vis 分光光度计对构建的HBV cccDNA阳性质粒以及1例HBV阳性临床肝组织样本制备的HBV cccDNA进行浓度测量，根据拷贝数计算公式得到拷贝数，然后按照浓度梯度稀释为104、103、102、101、100copies/μL。再利用数字PCR、荧光定量PCR和CRISPR-HBV cccDNA方法进行灵敏度检测比对及结果判读，试验重复3次。

1.11临床样本检出率的对比试验 提取25例HBV感染患者和5例非HBV感染患者肝组织样本的总DNA，按照HBV cccDNA的制备方法进行检测。再利用数字PCR、荧光定量PCR和CRISPR-HBV cccDNA方法进行检出率的比对及结果判读。试验重复3次。

1.12统计学分析 应用SPSS 25.0软件进行统计学分析。HBV cccDNA阳性质粒和阳性样本的灵敏度比对数据使用t检验，计数资料以例数(n)或百分率(%)表示，不同方法阳性率比较采用配对χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1CRISPR-HBV cccDNA检测方法的构建流程 如图1所示，从样本中提取总DNA后，经过HindⅢ内切酶和PSAD酶消化，先利用RCA引物进行扩增，然后通过带有T7启动子的PCR引物进行转录扩增，使双链DNA转录为单链RNA，再使用CRISPR-Cas13a体系对其进行检测，当特异性的crRNA识别到HBV cccDNA靶序列时，便会激发Cas13a蛋白活性，剪切荧光报告探针，从而发出荧光信号。

图1 CRISPR-HBV cccDNA检测方法示意图

2.2HBV cccDNA阳性质粒灵敏度对比试验 本研究建立的CRISPR-HBV cccDNA方法检测100copies/μL的荧光值(242 402.67±46 084.99)与阴性对照(NC)的荧光值(71 738.63±11 030.72)差异有统计学意义(t=5.093，P<0.01)，确定最低检测限为1 copies/μL。荧光定量PCR检测101copies/μL的Ct值(38.4±0.4)与NC(41.1±0.5)，差异有统计学意义(t=5.051，P<0.01)，确定最低检测限为101copies/μL。数字PCR检测101copies/μL的拷贝数(15.28+3.85)与NC(2.30±1.24)差异有统计学意义(t=3.170，P<0.01)，确定最低检测限为101copies/μL。结果见表2。

表2 3种方法检测HBV cccDNA阳性质粒的结果

2.3阳性样本灵敏度对比试验 本研究建立的CRISPR-HBV cccDNA方法检测100copies/μL的荧光值(39 033.70±446.53)与NC(3 600.32±161.34)的差异有统计学意义(t=105.5，P<0.0001)，确定最低检测限为1 copies/μL。qPCR检测101copies/μL的Ct值(34.78±0.65)与NC(40.35±0.59)差异有统计学意义(t=8.853，P<0.001)，确定最低检测限为10 copies/μL。ddPCR检测100copies/μL的拷贝数(6.50±0.81)与NC(3.70±0.72)差异有统计学意义(t=3.674，P<0.05)，确定最低检测限为1 copies/μL。结果见表3。

表3 3种方法检测HBV cccDNA阳性样本灵敏度的对比

2.4阳性样本特异性验证 标记了地高辛的HBV cccDNA探针和HBV rcDNA探针以及其对应的地高辛标记的对照组DNA均可以被检出，见图2A和B。当检测3个HBV cccDNA阳性细胞样本时，HBV cccDNA被检出，而HBV rcDNA未被检出，见图2C。

图2 Southern blot检测阳性样本的特异性

2.5临床样本检出率对比试验 25例HBV感染患者中，ddPCR法检测出16例,阳性率为64%(16/25)，qPCR方法检测出12例，阳性率为48%(12/25)，CRISPR-HBV cccDNA方法检测出20例，阳性率为80%(20/25)。ddPCR法与CRISPR-HBV cccDNA方法的阳性率差异有统计学意义(P=0.012 7)。5例非HBV感染患者中，ddPCR、qPCR和CRISPR-HBV cccDNA方法均未检出。见表4。

表4 3种方法检测临床样本的结果比较

3 讨论

在前期的研究中，笔者利用HindⅢ内切酶和PSAD酶分别对肝脏提取的DNA进行消化，然后依据rcDNA和cccDNA的结构差异，设计特异性扩增HBV cccDNA的引物，对酶切后的产物进行滚环扩增(RCA)和PCR扩增，并通过筛选靶向HBV cccDNA基因的crRNA序列，建立了基于CRISPR-Cas13a技术的HBV cccDNA检测新方法(命名为CRISPR-HBV cccDNA方法)。

Zhong等[9]利用RCA方法与qPCR方法相结合，显著提高了HBV cccDNA检测的灵敏度。另有学者利用CRISPR-Cas13a技术对新冠病毒、埃博拉病毒和流感病毒等进行了高灵敏度和高特异性地检测[10-11]。 本研究利用RCA方法和qPCR方法与CRISPR-Cas13a技术相结合，建立的CRISPR-HBV cccDNA检测方法对HBV cccDNA阳性质粒的检测灵敏度为1 copies/μL，显著高于ddPCR(101copies/μL)和qPCR(101copies/μL)方法；对阳性样本检测的检测灵敏度也为1 copies/μL，与ddPCR方法相同，亦高于qPCR(101copies/μL)方法。此外，本研究对于25例HBV感染的临床肝组织样本的检测结果表明，建立的CRISPR-HBV cccDNA方法检出阳性率为80%，均明显高于ddPCR(64%)和qPCR(48%)方法。

综上所述，本研究建立的CRISPR-HBV cccDNA方法，能对HBV感染患者肝组织的HBV cccDNA进行高灵敏度的检测，为评价HBV治疗效果，更好地指导临床用药提供了新的方法。

致谢：田原、万妍负责收集资料，开展实验；徐玲、张向颖负责分析数据，撰写文章；任锋、吴剑负责提供写作思路、指导并最终定稿。