基于代谢组学分析的18-三体妊娠羊水差异代谢物

张晓娟，李雅红，张燕, 孙云，蒋涛

(南京医科大学附属妇产医院&南京市妇幼保健院遗传医学中心,南京 210004)

18-三体(trisomy 18，T18)，又称爱德华综合征(Edwards syndrome，ES)，是仅次于21-三体的最常见的染色体异常之一，发病率为1/8 500～1/3 600，其临床表现多变，可累及多个器官和系统，患者存在颅面畸形、心脏畸形、智力低下和发育迟缓等[1]。虽然18-三体在上世纪60年代即被发现，但其具体病理机制仍未完全阐明，有待深入探索[2]。

近年来，代谢组学在疾病的发生机制、早期标志物发现、疾病诊断、疾病预后和治疗等方面已有较多应用[3-4]。羊水中含有羊膜上皮细胞、胎儿组织和胎盘组织产生的大量代谢物，可以反映胎儿发育过程中的生理病理状况[5]。因此，进行18-三体妊娠母体羊水的非靶向代谢组学研究具有重要意义。本研究基于气相色谱飞行时间质谱(gas chromatography time-of-flight mass spectrometry，GC-TOF/MS)的非靶向代谢组学方法探索18-三体妊娠母体羊水中代谢物的变化并寻找差异代谢物，以期为18-三体妊娠的病理机制研究提供新思路。

1 研究对象与方法

1.1研究对象 采用病例-对照研究，收集2012年1月至2013年12月在南京医科大学附属妇产医院医学遗传中心行胎儿染色体芯片分析确诊为18-三体的单胎妊娠母体羊水样本8例作为病例组，收集同期因血清学产前筛查高风险或高龄行胎儿染色体芯片分析的单胎妊娠母体羊水样本40例为对照组。所有参与研究的孕妇均来自江苏省，具有相同的种族背景，并排除妊娠期相关并发症，如高血压和糖尿病等。病例组排除18-三体以外的其他致病性染色体异常；对照组排除致病性染色体异常以及结构畸形，如先天性心脏病、开放性神经管畸形、唇腭裂、神经系统畸形和泌尿系统畸形等，出生后随访无异常。病例组男/女胎儿性别比为1∶7，孕妇年龄(28.28±2.85)岁，采样孕周为19～26周，中位孕周22.5周；对照组男/女胎儿性别比为18∶22，孕妇年龄(28.28±2.85)岁，采样孕周为20～24周，中位孕周21周。两组间胎儿性别组成(χ2=2.944，P=0.123)和孕妇年龄(t=0.020，P=0.984)差异均无统计学意义。然而，受临床因素影响，难以收集到孕周完全匹配的样本，两组间孕周差异存在显著统计学意义(Z=-2.218，P=0.027)。所有样本均置于-20 ℃保存。本研究经南京医科大学附属妇产医院医学伦理委员会审核批准[宁妇伦字(2018)91号]，免除知情同意。

1.2试剂和仪器 Pegasus HT气相色谱/飞行时间质谱(GC-TOF-MS)联仪(美国Leco公司)，真空离心浓缩仪和低温冷冻干燥机(美国Labconco公司)，Rxi-5色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Restek公司)，超纯水(由配备LC-MS Pak过滤器的Mill-Q Reference系统产生，美国Millipore公司)，自动进样玻璃瓶(美国Agilent公司)。[N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)+三甲基氯硅烷(TMCS)，体积比99∶1]、甲醇、二氯甲烷、乙腈、氯仿、己烷和丙酮(美国Thermo-Fisher公司)，脂肪酸甲酯(C7-C30, FAMEs)标准品、甲氧基胺盐酸盐、无水硫酸钠和吡啶(美国Sigma公司)。

1.3样本检测 样本制备、质谱条件和质谱检测方法参照本课题组前期实验方法进行[6]。

1.3.1样本制备 羊水样本冰浴下缓慢解冻，4 ℃、3 000×g离心3 min；取100 μL上清置于预冷的EP管中，加入10 μL内标液，轻微混匀后再加入200 μL预冷的甲醇∶氯仿(3∶1，v/v)混合溶液，混匀后4 ℃、14 000×g离心20 min;取200 μL上清至1.5 mL的自动进样瓶，置于真空离心浓缩仪中旋干5 min后转移至低温冷冻干燥机完全冻干；恢复室温后充入高纯氮气保护，自动压盖保存。置于自动衍生平台XploreMET 进行硅烷化衍生，步骤：加入20 mg/mL甲氧胺吡啶溶液50 μL，30 ℃温育2 h，加入50 μL MSTFA(含保留指数FAMEs)，37.5 ℃温育1 h。衍生好的样本由进样臂自动进样。

1.3.2GC-TOF-MS检测 步骤：载气为氦气(99.999 9%)，进样量为1 μL，流速恒定1.0 mL/min；GC温度编程设定:在80 ℃下等温加热2 min，以12 ℃/min的速率升温至300 ℃(4.5 min)，再以40 ℃/min的速率升至320 ℃，维持1 min；前进样口及传输线温度均设定为270 ℃。MS检测具体设置：电子轰击电离(-70 eV)；离子源温度为220 ℃；探测器电压为-1 450 V；采集速率为25 spectra/s；检测质量范围为50～500 m/z。

1.4数据及统计学分析 GC-TOF/MS生成的原始数据由XploreMET 3.0软件处理，包括自动基线去除、平滑、峰识别和解卷积、质量控制、矫正，然后将保留指数和质谱数据与JiaLib代谢物数据库进行比对，并进行物质鉴定[7]。采用开源分析软件MetaboAnalyst 5.0进行峰面积归一化和正态转化，建立主成分分析(Principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(Orthogonal partial least square discri mination analysis，OPLS-DA)模型。使用SPSS 22.0软件进行Mann-WhitneyU检验、Student′st检验和逻辑回归分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1多维分析结果 无监督的PCA模型分析表明，病例组与对照组之间无明显分离趋势(图1A)。有监督的OPLS-DA模型(图1B)观察到两组之间的分离趋势(R2Y=0.878，Q2=0.038)，然而，这种分离趋势是因模型过拟合引起，模型置换检验显示P=0.065。PCA和OPLS-DA模型均证实病例组与对照组之间的代谢谱差异无统计学意义。

注：A，无监督PCA模型；B，有监督OPLS-DA模型。

2.218-三体差异代谢物 经逻辑回归校正孕周和胎儿性别，病例组和对照组间共发现5种差异代谢物，分别为甘油醛、葡萄糖酸、硫酸吲哚酚、磷酸盐和泛酸，且这些代谢物在病例组中显著增加(表1)。

表1 病例组与对照组羊水差异代谢物及其变化趋势

3 讨论

18-三体是常见的染色体异常疾病，病变累及几乎所有器官和系统，但其病理机制尚未完全阐明。本研究应用非靶向代谢组学方法探究18-三体妊娠代谢谱的差异，以期寻找差异代谢物。结果表明，采用PCA和OPLS-DA模型证实18-三体妊娠羊水样本与正常对照样本总体代谢谱间的差异无统计学意义。然而，甘油醛、葡萄糖酸、硫酸吲哚酚、磷酸盐和泛酸在病例组中的表达水平显著增加。

甘油醛是糖类代谢的中间产物，在高血糖状态下参与甘油醛衍生的晚期糖基化终产物的形成，引起血管炎症和内皮功能障碍，并在包括癌症在内的许多疾病的发病机制中起着重要作用[8]。葡萄糖酸是葡萄糖的氧化产物，与氧化应激有关，亦可能与高血糖所致的细胞毒性脑损伤有关[9]。18-三体胎儿所表现出的全身性器官累及可能与高甘油醛所致的血管炎症和内皮功能障碍有关，同时患儿的认知障碍可能与葡萄糖酸相关的细胞毒性脑损伤有关。然而，甘油醛和葡萄糖酸与18-三体相关的研究鲜见报道。

磷酸盐稳态对机体至关重要，其在多种生物过程和信号转导中发挥重要作用，高浓度的磷酸盐是肾脏和心血管疾病的危险因素，可导致心脏重构[10]。Sun等[11]的研究表明，硫酸吲哚酚的积累会破坏中枢神经系统，导致小鼠焦虑、抑郁和认知障碍。已知18-三体患者常存在心脏畸形和认知障碍，而磷酸盐和硫酸吲哚酚水平增加与心血管疾病相关，且硫酸吲哚酚对神经系统有一定损害，因此，推测磷酸盐和硫酸吲哚酚水平的增加可能在18-三体的病理机制中发挥一定的作用。泛酸即维生素B5，是辅酶A合成的必需水溶性微量元素，而辅酶 A 是 TCA 循环和脂肪酸代谢的关键辅助因子[12]。但目前尚未发现泛酸与18-三体之间的相关报道。

本研究存在以下不足之处：首先，病例组样本数量相对较少，且缺少大量样本验证；其次，未对差异代谢物进行相关功能研究。在后续的研究中，笔者将对找出的差异代谢物进行验证，并对验证的差异代谢物进行相关功能研究。 综上所述，本研究通过非靶向代谢组学的研究发现18-三体胎儿母体羊水中存在多种代谢物的变化，为18-三体病例机制的研究提供了更多研究思路。