古树普洱茶生茶贮藏过程中香气成分的变化

赵 阳，龚加顺，王秋萍

（云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201）

普洱茶是我国特有历史名茶，也是典型的地理标志产品，按其加工工艺及品质特征，分为普洱茶（生茶）和普洱茶（熟茶）2种类型[1]。普洱茶（生茶）是以地理标志保护范围内生长的云南大叶种茶树鲜叶为原料，经鲜叶摊放、杀青、揉捻、解块、日光干燥、精制、蒸压成型等工艺制成的茶叶，根据加工工艺的不同，可分为散茶和紧压茶，其品质特征为外形色泽墨绿、香气清纯持久、滋味浓厚回甘、汤色绿黄清亮，叶底肥厚黄绿[1]。 云南省是世界上重要的茶树原产地之一，有丰富的古茶树资源，至今在西双版纳、普洱、临沧等地还保存有大量野生型、过渡型、人工栽培型古茶树[2-3]。古树普洱茶生茶特指利用树龄在100 a以上茶树上采摘的茶叶，按照生茶工艺制作的普洱茶[3]。古树普洱茶因其资源稀少、产量低，且更自然、低农残、低污染等特点和优势，很受消费者欢迎[4]。

古树普洱茶生茶水浸出物、茶多酚、咖啡因、简单儿茶素、游离氨基酸、可溶性总糖以及醛类、酮类等香气成分在种类和含量上均高于台地普洱茶生茶，尤其 1-辛烯-3醇、芳樟醇氧化物II、α-萜品醇、苯甲醛等呈现木香和樟脑气息成分较高，因此赋予古树生茶滋味醇厚、浓烈、鲜爽、回甘快，韵味持久，香气浓郁、高远的品质特点[5]。研究表明，香气对茶叶品质的贡献率达25%～40%，是决定茶叶品质的重要因素，此外，根据香气特征的差异，在一定程度上，也是区分茶品质特征的重要指标[6-7]。而加工工艺和贮藏时间对普洱茶品质均有较大影响，贮藏过程对普洱生茶香气影响最为显著，经过长时间贮藏在自然发酵作用下普洱生茶能够转化为陈茶，且时间越长，品质越好[8-10]。大量研究表明，普洱茶香气成分组成十分复杂，且在发酵过程中形成了独特的香气，随发酵的进行，如苯甲醇、氧化芳樟醇、芳樟醇等呈现果香型成分逐渐减少，以及具有木香、萜香特征的含氧萜类物质大量减少，而1,2,3-三甲氧基苯、 1,2-二甲氧基苯等呈现陈香型成分的甲氧基芳香族化合物逐渐增加，因此经长期贮藏的普洱生茶具有陈香特点，表现出陈年普洱生茶的品质特征[11-13]。由于普洱茶具有越陈越香的特点，茶商和消费者热衷于收藏普洱茶。目前关于古树普洱茶生茶在贮藏过程中理化成分、感官品质和活性成分的变化研究较少，探明古树普洱茶贮藏过程中感官品质和香气成分的变化，有利于科学确定古树普洱茶的贮藏时间，进而促进茶叶增值。

曼竜位于西双版纳州勐海县勐混镇贺开村，茶树于贺开山原始森林中自然生长，海拔在1 400～1 800 m之间，分布着树龄百年以上的栽培型古茶树，且古茶树树龄均衡。这里常年云雾围绕，山峦连绵，沟谷纵横，气候温暖，日照充足，雨量丰沛，土地肥沃，年平均气温17 ℃，古茶树生长较为缓慢，使茶叶中的内含物丰富。老曼俄地处云南省西双版纳州勐海境内布朗山的中心地带，海拔1 650 m，年平均气温18～21 ℃，年降水量1 374 mm，常年高温湿润。茶树分布村落四周，主要以栽培型古茶树为主，茶树龄在100～500 a左右，古茶园保持原始生态环境，茶树生长于其他杂木树林里面，生长情况良好，终年不施用农药和化肥，确保茶叶的独特品质。落水洞地处云南西双版纳州勐腊县易武乡麻黑村，是麻黑村古树茶的中心产区，也是易武山中普洱茶历史最悠久的寨子之一，茶树多数属于矮化的古树茶，树龄大约在300～500 a之间。海拔约1 463 m，年平均气温17 ℃，年降水量1 800～2 100 mm，常年云雾缭绕，温热多雨，土层深厚，土壤肥沃，富含各类微量元素，其次茶农认真管理茶园，定期清理杂草，茶树生长良好。

本实验以云南省西双版纳州贺开古茶山曼竜村、布朗古茶山老曼俄村、易武古茶山落水洞村3个不同产地古树生茶为对象，选取不同贮藏时间的古树普洱茶生茶，对其进行感官评定，并采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用进行香气成分分析比较，揭示不同贮藏期以及不同产地古树普洱茶生茶感官品质和香气成分差异，以期为古树普洱茶贮藏条件提供一定理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

11个古树普洱茶生茶样品均由云南臻字号茶业有限责任公司提供，各茶样贮藏于温度为20～30 ℃，相对湿度为40%～50%，干燥、通风、无异味的环境中。样品信息见表1，按四分法对各饼茶样均匀取样，置于4 ℃冰箱保存，待用。

表1 古树普洱茶生茶样品信息Table 1 Information on raw Pu-erh tea from ancient tea trees

癸酸乙酯、正构烷烃（C6～C30）（均为色谱纯，纯度＞98.0%） Sigma-Aldrich（上海）公司。

1.2 仪器与设备

QP2010Ultra气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司； 50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS/DVB）萃取头、固相微萃取装置、手动进样柄 美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 感官评审

按照GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》[14]，由8 位云南农业大学龙润普洱茶学院的国家高级评茶员对古树普洱茶生茶进行感官审评。

1.3.2 香气成分测定[15]

香气成分采集：取2.0 g样品置于20 mL顶空瓶中，将老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取头插入样品瓶顶空部分，于60 ℃吸附30 min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250 ℃解吸3 min，同时启动仪器采集数据。

气相色谱条件：进样口温度250 ℃；载气为高纯氦气（99.999%），不分流进样；柱流量0.8 mL/min；升温程序为初温40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升温至90 ℃，以10 ℃/min升温至230 ℃，保持7 min。

质谱条件：电子电离源；电离能量70 eV；发射电流为100 μA；接口温度250 ℃；离子源温度200 ℃；检测电压1 000 V。

1.4 数据处理

采用QP2010Ultra GC-MS自带数据库（NIST2014）及Wiley8.0检索数据库检索定性分析，不同产地茶叶间香气成分采用峰面积归一化法定量分析，同一产地不同贮藏时间茶叶香气成分差异采用峰面积比表示。采用Simca14.1软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA），并结合预测变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）（VIP＞1.00）筛选标志成分。

2 结果与分析

2.1 古树普洱茶生茶贮藏过程中感官品质的变化

如表2所示，随贮藏时间的延长，茶叶色泽、汤色、香气、滋味均发生一定的变化。曼竜茶样茶叶色泽贮藏3～6 a内变化较明显，由墨绿变为褐黄；老曼俄茶样贮藏10 a由墨绿变为褐黄；落水洞茶样在贮藏前3 a由绿褐变为墨绿。汤色上曼竜茶样由黄绿变为橙黄；老曼俄茶样首先由黄绿变为绿黄，接着变为橙黄，最后变为橙红。香味上曼竜和落水洞茶样没有发生明显变化；老曼俄茶样由清香变为陈香，呈现出陈年普洱生茶品质特征。滋味上曼竜茶样由浓厚鲜爽回甘逐步变得醇和；老曼俄茶样由浓厚回甘变为浓醇回甘；落水洞茶样由醇厚回甘变为浓醇回甘。由此可以看出古树普洱茶生茶经长期贮藏后能够提升其感官品质。

表2 古树普洱茶生茶感官审评结果Table 2 Sensory evaluation results of raw Pu-erh tea from ancient tea trees

不同产地古树普洱茶生茶在贮藏过程中感官品质变化程度差异较大，这与贮藏条件有较大关系，如含氧量、温度、湿度等，尤其湿度是普洱茶品质形成的重要因子。由于温度和湿度的变化，茶叶在自然发酵过程中微生物及茶叶体内各种酶活性有一定差异，进而影响茶叶中各种化学成分的变化程度，从而导致感官品质变化程度的差异[11]。

2.2 古树普洱茶生茶贮藏过程中香气成分的变化

2.2.1 同一产地不同贮藏时间茶样香气成分OPLS-DA

茶叶香气是决定茶叶品质的重要因子，茶叶中的芳香物质是多种物质组成的混合体。它们各具不同的气味，有的具有青草气，有的表现出鲜花香，有的在高浓度下呈难闻的气味，而在低浓度下呈愉快的香味。采用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱结合技术对不同贮藏年限古树普洱茶生茶香气成分进行测定，共测定出283个香气成分，分为碳氢化合物、醇类、杂氧化合物、醛类、酮类、酯类、酸类、酚类、醚类，其离子流色谱图如图1所示，以2018年老曼俄茶样为例。

图1 古树普洱茶生茶香气成分总离子流色谱图Fig. 1 Total ion current chromatogram of aroma components of raw Pu-erh tea from ancient tea trees

采用Simca14.1软件分别对同一产地不同贮藏时间茶样香气成分进行OPLS-DA，通过VIP得分图找出不同贮藏时间茶样主要差异物质，其中VIP值大于1的成分为不同贮藏时间古树普洱茶生中主要差异香气成分，最后以其峰面积比大小分析各组分随贮藏时间延长的变化情况。

由图2可知，对不同贮藏时间的曼竜、老曼俄、落水洞古树普洱茶生茶样品逐一进行OPLS-DA内部两两判别分析，各茶样在95%置信区间内均分布于不同区域，有明显的区分，说明同一产地不同贮藏时间的古树普洱茶香气成分含量有一定差异。通过VIP值鉴定分析，不同贮藏时间茶样主要差异香气成分如图3、表3～5所示。

图2 不同贮藏时间古树普洱茶生茶香气成分OPLS-DA得分图Fig. 2 OPLS-DA score plots of aroma components of raw Pu-erh tea of different ages from ancient tea trees

图3 不同贮藏时间古树普洱茶生茶香气成分VIP得分图Fig. 3 VIP scores of aroma components of raw Pu-erh tea of different ages from ancient tea trees

2.2.2 不同贮藏时间曼竜茶样香气成分变化

由表3可知，不同贮藏时间曼竜茶样中甲苯、D-柠檬烯、α-松油醇、间异丙基甲苯、二十一烷、十二烷、己醛、异丁酸异丁酯、4-萜烯醇、4,6-二甲基十二烷、月桂烯、萜品烯、萜品油烯含量随贮藏时间延长有所上升，其中以α-松油醇、间异丙基甲苯变化最为明显。 1-辛烯-3-醇、二甲基硫、芳樟醇、顺式芳樟醇氧化物（呋喃）、2,2,4,6,6-五甲基庚烷、1-戊醇、正丁烷、3-甲基-3-戊烯-2-酮、芳醇氧化物、甲基庚烯酮、正己酸乙酯随贮藏时间延长而降低，尤其到贮藏后期，1-辛烯-3-醇、1-戊醇、正己酸乙酯下降幅度达到数十倍。脱氢芳樟醇、橙花叔醇在贮藏前3 a明显上升，后期大幅度下降。

表3 贮藏时间对曼竜古树普洱茶生茶香气成分的影响Table 3 Effect of storage time on aroma components of raw Pu-erh tea from ancient tea trees growing in Manlong village

2.2.3 不同贮藏时间老曼俄茶样香气成分变化

由表4可知，不同贮藏时间老曼俄茶样中D-柠檬烯、橙花叔醇、α-松油醇、甲苯、脱氢芳樟醇、间异丙基甲苯、3,7-二甲基己烷、2,6,11-三甲基十二烷、4-萜烯醇、己醛、十四烷、1,2,4-三甲氧基苯、4,6-二甲基十二烷、长叶烯、2-甲基十一烷、月桂烯、1,4-二甲氧基苯在贮藏过程中含量有所增高，尤其α-松油醇、间异丙基甲苯、2,6,11-三甲基十二烷、长叶烯变化幅度较大，在贮藏后期分别增加了6、9 倍和10 倍，长叶烯含量在前3 a上升了约30 倍。1-辛烯-3-醇、二甲基硫、2,3-辛二酮、1-戊醇、芳樟醇、正己酸乙酯、顺式芳樟醇氧化物（呋喃）、反式芳樟醇氧化物（呋喃）随贮藏时间延长含量降低，尤其1-辛烯-3-醇、二甲基硫、1-戊醇含量下降幅度最大，到后期呈数十倍下降。而乙酸、脱氢芳樟醇、己酸、 3-甲基-3-戊烯-2-酮、1-石竹烯、β-紫罗兰酮，含量则呈现先增后减的变化趋势。

表4 贮藏时间对老曼俄古树普洱茶生茶香气成分的影响Table 4 Effect of storage time on aroma components of raw Pu-erh tea from ancient tea trees growing in Laomane village

2.2.4 不同贮藏时间落水洞茶样香气成分变化

由表5可知，不同贮藏时间落水洞茶样中D-柠檬烯、3,7-二甲基己烷、橙花叔醇、己醛、α-松油醇、芳樟醇、间异丙基甲苯、1,4-二甲氧基苯、2,4,4-三甲基-1-戊烯随贮藏时间延长含量上升，尤其橙花叔醇上升幅度最大，约增加了17 倍。1-辛烯-3-醇、二甲基硫、2,6,11-三甲基十二烷、芳樟醇、顺式芳樟醇氧化物（呋喃）、2,3-辛二酮、1-戊醇、正己酸乙酯、丙酸丁酯、芳醇氧化物、顺-2-辛烯醇随贮藏时间延长含量降低，尤其二甲基硫、正己酸乙酯、丙酸丁酯到后期含量大幅度下降。

表5 贮藏时间对落水洞古树普洱茶生茶香气成分的影响Table 5 Effect of storage time on aroma components of raw Pu-erh tea from ancient tea trees growing in Luoshuidong village

茶叶中醇类化合物通常具有花香、果香及木香气息，且对普洱茶生茶香气具有较好的协调性，比如1-辛烯-3-醇的呈香特征为果香和木香，芳樟醇氧化物有强烈木香和花果香并带有樟脑气息，松油醇具有花香和紫丁香气息，氧化芳樟醇为木香和花香特征，芳樟醇表现为果香、花香和木香[16-17]；醛类物质具有花香和清香气息；甲氧基苯类物质是由普洱茶生茶贮藏过程中自然陈化产生，具有陈香气息，是普洱茶陈香风味的主要贡献者[18-19]， 主要有3,4-二甲氧基甲苯、1,2,4-三甲氧基苯、1,2,3-三甲氧基苯、1,2-二甲氧基苯等[20-22]。酮类、酯类化合物大多也具备花果香，其中酮类化合物中β-紫罗兰酮也伴有特殊的木香[23]；碳氢类化合物中的饱和烃对茶香气贡献较小，不饱和烃对茶香气贡献较大[24]。

综合各产地茶叶中香气成分变化情况，曼竜、老曼俄、落水洞3个产地不同贮藏时间古树普洱茶生茶中D-柠檬烯、己醛、α-松油醇、4-萜烯醇、脱氢芳樟醇、橙花叔醇等具有花果香气息成分和甲苯、间异丙基甲苯峰面积随贮藏时间延长而上升，1-辛烯-3-醇、二甲基硫、顺式芳樟醇氧化物（呋喃）、芳樟醇、1-戊醇、正己酸乙酯均随贮藏时间延长而降低，与曹艳妮等[25]对不同贮存时间普洱生茶香气成分研究结果相似。老曼俄生茶中1,4-二甲氧基苯、1,2,4-三甲氧基苯、1,3-二甲氧基苯3种陈香型成分在贮藏后期含量有所上升，与王利妍等[26]研究结果相似；落水洞生茶1,4-二甲氧基苯随贮藏时间延长含量大幅度上升。此结果与表2感官审评结果中不同贮藏时间曼竜和落水洞生茶香气均为清香，老曼俄生茶到贮藏后期带有陈香气息结论相同，而其清香程度的降低可能与甲苯、间异丙基甲苯等苯类物质含量上升及1-辛烯-3-醇、芳樟醇、1-戊醇、正己酸乙酯等成分含量降低有关。

普洱茶生茶特殊香气成分主要在长期贮藏过程中通过缓慢自然发酵形成，贮藏过程中经过缓慢发酵使其在微生物分泌的胞外酶的酶促作用、微生物呼吸代谢产生的热量和茶叶水分的湿热协同下，茶叶香气组分中 1,4-二甲氧基苯、1,2,4-三甲氧基苯、1,3-二甲氧基苯等甲氧基苯类物质大量增加，呈现出陈香气息，各种挥发性成分的丰度及香气阈值共同影响着普洱茶香气品质[18-26]。贮藏方式对普洱茶香气成分的形成有较大影响，不同贮藏方式会影响茶叶发酵条件，导致茶样品质发生变化。自然贮藏茶叶品质完全受存放地气候条件影响，空气湿度高的地方茶叶容易吸入湿气，发生变质，还会产生异味，其次茶叶中的活性酶会快速失去，让茶叶后期化学成分的变化失去动力源。密封存储可以长时间保留茶叶香味，由于保留了活性酶，在后期贮藏过程中茶叶中各种复杂化学成分可以继续变化，但在后续发酵时需要氧气和一定湿度，使茶叶活性酶能够促进成分的变化[27]，所以普洱茶应在标准贮藏库中贮藏。

成分决定品质，古树普洱茶生茶在贮藏过程中，经过了一系列的复杂变化，不同贮藏时间茶叶色泽、汤色、滋味、香气均有一定差异，形成其特有的品质，目前已有相关文献研究报道普洱茶关键香气成分[28-30]。本研究对不同贮藏时间的古树普洱茶生茶香气成分进行测定，分析在贮藏过程中变化较大的香气成分，各香气成分与感官品质的相关性有待进一步研究。

2.3 不同产地古树普洱茶生茶香气成分比较

普洱茶中化学成分复杂多样，由于区域性气候差异分明、年温差小、日温差大，相同的茶树品种在不同区域内生长也会使其所产茶叶品质有较大不同[30]。对2018年产自贺开山曼竜村、布朗山老曼俄村、易武山落水洞村的古树普洱茶生茶香气成分通过峰面积归一化进行定量，结果以相对含量表示。对各成分进行PCA （图4A），并结合预测变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）（VIP＞1）筛选差异组分（图4B），进一步分析各产地茶叶香气物质组成特征。3个产地茶叶香气成分相对含量如表6所示。

图4 不同产地古树普洱茶生茶香气成分PCA得分图（A）和 VIP得分图（B）Fig. 4 PCA plot (A) and VIP scores (B) of aroma components of raw Pu-erh tea from ancient tea trees growing in different regions

表6 不同产地古树普洱茶生茶香气成分含量Table 6 Aroma components of raw Pu-erh tea from ancient tea trees growing in different regions

续表6

由表6可知，在2018年曼竜生茶中甲苯、橙花叔醇、1,4-二甲氧基苯、3-甲基-3-戊烯-2-酮、D-柠檬烯、2,2,4,6,6-五甲基庚烷、顺式芳樟醇氧化物（呋喃）、芳樟醇、香叶醇、α-松油醇、芳樟醇氧化物等成分相对含量均高于老曼俄和落水洞茶样，尤其是具有清香气息的甲苯、芳樟醇、顺式芳樟醇氧化物（呋喃）、橙花叔醇其相对含量分别为11.24%、4.32%、2.81%、1.55%。其感官审评结果也显示未经贮藏的曼竜生茶香气特征为清香型，且其清香度均较老曼俄和落水洞生茶馥郁。

2018年老曼俄生茶中乙酸、己酸、十一烷、反式芳樟醇氧化物（呋喃）、2,5-二甲基九烷、1-戊醇、2-戊基呋喃、正己酸乙酯物质相对含量较高，其中乙酸和1-戊醇相对含量明显高于其他茶样，分别为1.70%、1.82%。相关研究显示，乙酸具有香叶、玫瑰香气息[19]。

2018年落水洞生茶中二十一烷、2,6,11-三甲基十二烷、1-辛烯-3-醇、2,3-辛二酮、丙酸丁酯、异丁酸异丁酯、十二醛、二甲基硫、3,5,5-三甲基环己-2-烯酮、β-紫罗兰酮、4-萜烯醇、β-环柠檬醛相对含量较高。其中具有果香气息的1-辛烯-3-醇、β-紫罗兰酮、β-环柠檬醛相对含量在3个茶样中最高，分别为6.43%、0.76%、0.52%。

整体上看，3个产地古树普洱茶生茶甲苯、1-辛烯-3-醇、D-柠檬烯、顺式芳樟醇氧化物（呋喃）、芳樟醇、十二烷等成分相对含量较高，为古树普洱茶生茶中主要香气物质，与曾敏等[5]研究结果相似。念波[21]、Lü Haipeng[30]等研究发现(3R,6R)-2,6-三甲基-6-乙烯基四氢-2H-吡喃-3-醇、苯乙醇、松油醇、氧化芳樟醇、苄醇、乙酸、肌氨酸和芳樟醇等可以作为花果香型与陈香型区分的标志物。4-乙基-1,2-二甲氧基苯、1,2,4-三甲氧基苯、1,2,3-三甲氧基苯、1,2,3-三甲氧基-5-甲基苯等可作为陈香型标志物。综上，未经贮藏的古树普洱茶生茶香气特征为清香型，其清香程度可能与甲苯、1-辛烯-3-醇、D-柠檬烯、顺式芳樟醇氧化物（呋喃）、芳樟醇、乙酸等具有花果香气息成分含量高低有关。

3 结 论

未经贮藏的古树普洱茶生茶香气特征为清香型，甲苯、1-辛烯-3-醇、D-柠檬烯、顺式芳樟醇氧化物（呋喃）、芳樟醇、十二烷等成分相对含量较高。随贮藏时间延长，古树普洱茶生茶汤色变得橙黄明亮，滋味更醇，曼竜和落水洞茶样香气清香程度降低，老曼俄茶样转变为陈香，显现陈年普洱生茶感官特征。古树普洱茶生茶中D-柠檬烯、己醛、α-松油醇、4-萜烯醇、脱氢芳樟醇、橙花叔醇等具有花果香气息成分和甲苯、间异丙基甲苯及甲氧基苯类物质随贮藏时间延长而增加，当贮藏时间达到10 a时，1,4-二甲氧基苯、1,2,4-三甲氧基苯、1,3-二甲氧基苯3种具有陈香特征成分大量升高。可见，古树普洱茶生茶经长期（6 a及以上）贮藏能提高其感官品质，逐渐呈现出陈年普洱生茶品质特征，这与贮藏过程中各类香气成分组成及含量变化有关。