基于电子舌检测快速判别不同物种畜禽骨蛋白肽

刘 泓，郭玉杰,*，陈永凯，李 侠，张鸿儒，韩 东，张春晖,*，姜 珊

（1.中国农业科学院农产品加工研究所，农业农村部农产品加工综合性重点实验室，北京 100193；2.内蒙古阿荣旗牧源康肽实业有限公司，内蒙古 呼伦贝尔 162750）

中国是畜禽肉类生产和消费大国，每年产生约 1 700万 t的畜禽骨，居世界首位[1]。畜禽骨中富含蛋白（主要为骨胶原蛋白）、多糖、矿物质等多种营养组分[2]，是生产功能性骨源食品的重要原料。研究表明，骨胶原蛋白经酶解产生的功能多肽具有抗氧化[3]、 抗菌[4]、血管紧张素转换酶抑制性[5]、抗阿尔茨海 默症[6]、呈味[7]、免疫调节[8]、促成骨细胞增殖[9-12]、改善关节炎[13-14]、增强骨密度及抗骨质疏松[15-17]等多种生理活性。Kolodziejska等[18]的研究表明畜禽骨胶原蛋白肽可显著提高骨密度、刺激软骨细胞合成II型胶原以增加骨骼的稳固性，对骨质疏松、骨关节炎等疾病有潜在的改善和治疗作用。Guillerminet等[19]发现牛、猪、鱼骨胶原蛋白肽对成骨细胞的增殖及分化效果显著。Elam等[20]发现骨胶原蛋白肽可显著改善绝经后女性的骨量流失。胶原蛋白及其多肽在食品、药品、化妆品、药物输送及骨组织工程等行业中的应用日益广泛，2018年全球胶原蛋白市场规模约为42.7亿 美元，预计在2025年将达66.3亿 美元，开发高附加值功能型产品的潜力巨大[21]。2015—2019年全球共发布了3 200多种胶原蛋白肽运动营养型食品[22]，我国丰富的畜禽骨资源使畜禽骨蛋白及其多肽的市场前景广阔，需求规模不断扩大[23]。

目前用于生产畜禽骨蛋白肽的原料骨主要有牛骨、猪骨、鸡骨等畜禽骨[24]。畜禽骨原料差异与骨蛋白肽的功能活性密切相关，不同物种畜禽骨原料价格差异亦较大，这直接决定了骨蛋白肽产品生产成本的不同[25]，导致畜禽骨蛋白肽市场存在以次充好销售等问题，侵害消费者的经济权益及身心健康。因此，有必要建立一种针对不同物种畜禽骨蛋白肽进行定性判别鉴定的快速有效的分析方法。目前，用于食品定性判别的方法包括：感官检验法、品质相关理化指标的化学分析法、基于蛋白质的分析方法（免疫分析、色谱分析法、质谱分析法、红外光谱法等）、基于核酸的分析方法（分子标记分析、实时聚合酶链式反应等）[26]，但均存在检测耗时长、判别效果差、样品预处理繁杂、人员需要特殊训练等问题，并不适用于畜禽骨蛋白肽的检测判别。

电子舌是近年发展起来的由交互敏感传感器阵列、信号调整电路以及自带的模式识别算法软件构成的一种新型味觉分析检测仪器[27]，通过模拟人体5种基本味感（酸、甜、苦、咸、鲜）将食品液体的滋味特征转化为电信号响应值经分析将滋味特征量化[28]，具有客观性强、稳定性好、工作效率高、检测阈低的优点[29]，便于实时检测、快速分析[30]。本实验基于不同畜禽骨原料生产的骨蛋白肽的味觉特征差异，探究利用电子舌快速判别鉴定不同物种畜禽骨蛋白肽的可行性，以期为畜禽骨蛋白肽掺杂掺假检测研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牦牛骨蛋白肽（yak bone peptides，YBPs） 内蒙古自治区呼伦贝尔市阿荣旗牧源康肽生物科技有限公司； 黄牛骨蛋白肽（bovine bone peptides，BBPs） 山东海钰生物股份有限公司；猪骨蛋白肽（pig bone peptides，PBPs） 北京太爱肽生物工程技术有限公司；鸡骨蛋白肽（chicken bone peptides，CBPs） 浙江辉肽生命健康科技有限公司。每个物种畜禽骨蛋白肽包含4 份种内样本，成品均为干燥粉末状，将4 份种内样本均匀混合用于电子舌分析检测。

氢氧化钠、盐酸、硫酸钾、乙醇（体积分数95%）、石油醚（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；氨基酸混合标准溶液（色谱级） 美国Sigma-Aldrich公司；石英砂、脱脂棉、滤纸等。

1.2 仪器与设备

BD(E2)型热风循环箱 德国Binder仪器公司； ZK-GQ18-17TP型马弗炉 北京中科北仪科技有限公司；N310型免水全自动凯氏定氮仪 广州格丹纳仪器有限公司；Soxtec 8000型自动索氏抽提器 丹麦Foss公司；Allegra X-12型台式高速冷冻离心机 美国Beckman Coulter公司；L-8800型氨基酸自动分析仪 日本日立 公司；α-Astree电子舌 法国Alpha MOS公司。

1.3 方法

1.3.1 畜禽骨蛋白肽基本营养组分的测定

水分含量测定：参照GB 5009.3—2016《食品中水分含量的测定》；灰分含量测定：参照GB 5009.4—2016《食品中灰分含量的测定》；粗蛋白含量测定：参照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质含量的测定》，由于畜禽骨蛋白中主要为胶原蛋白，粗蛋白含量的蛋白换算系数为5.79；粗脂肪含量测定：参考GB 5009.6—2016《食品中脂肪含量的测定》。每份样本测定3 次，每种畜禽骨蛋白肽的4 份种内样本取平均值。

1.3.2 畜禽骨蛋白肽氨基酸组成分析

取65～70 mg畜禽骨蛋白肽粉（精确到0.1 mg）及20 mL 6 mol/L HCl溶液，加入水解管中，密封，105 ℃水解20 h后将溶液过滤，超纯水定容至100 mL容量瓶中。取1 mL溶液氮吹，然后用0.5 mol/L HCl溶液稀释10 倍后用0.22 μm水相滤膜过滤，取1 mL装入进样瓶待全自动氨基酸分析仪检测。每份样本测定3 次，每种畜禽骨蛋白肽的4 份种内样本取平均值。

1.3.3 畜禽骨蛋白肽溶液制备

准确称取10 g畜禽骨蛋白肽粉溶解于100 mL热的超纯水中，4 ℃、4 000 r/min离心20 min，先后用纱布过滤及普通滤纸抽滤，最后用0.45 μm滤膜砂芯抽滤，取滤液备用。

1.3.4 电子舌检测

采用电子舌检测系统，包含由7 根味觉传感器组成的交叉敏感电位传感器阵列、Ag/AgCl参比电极[31]、机械搅拌器、16 位自动进样器以及数据采集分析系统。表1列出了7种传感器的性能，传感器的分子膜可选择性吸附不同的滋味物质，将滋味特征转化为电信号数据[32]。电子舌经过活化和校准后，取80 mL畜禽骨蛋白肽溶液按顺序加入125 mL检测杯中。单次采样时间120 s，样品间采用超纯水清洗10 s，采集周期为1 次/s，搅拌速率3 r/s，室温下采集数据。每份畜禽骨蛋白肽样品重复检测7 次[33]，不区分畜禽骨蛋白肽种内样本来源，将4 份种内样本均匀混合用于畜禽骨蛋白肽种间样本的检测判别。4种畜禽骨蛋白肽一共产生28 组滋味数据以进行滋味特征分析。

表1 α-Astree电子舌化学选择性区域效应传感器性能描述Table 1 Performance descriptions of chemically sensitive field-effect transistor sensors employed in α-Astree electronic tongue

1.4 数据分析

畜禽骨蛋白肽基本营养组分含量及氨基酸组成使用SPSS 25.0软件进行Duncan方差分析：P＜0.05，差异显著；P＜0.01，差异极显著。畜禽骨蛋白肽溶液滋味检测数据由电子舌软件系统进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和判别因子分析（discriminant factor analysis，DFA），使用SIMCA 14.1软件进行偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）[34]。从28 组数据中随机选取12 组作为训练集，其余16 组均为测试集，利用SPSS 25.0建立Fisher判别函数模型[28]。结果以±s表示，采用Origin 9.1软件作图。

2 结果与分析

2.1 畜禽骨蛋白肽营养组分分析

2.1.1 畜禽骨蛋白肽基本营养组分分析

如表2所示，畜禽骨蛋白肽主要成分为水分、灰分、粗蛋白等。水分质量分数在4%～6%之间，CBPs水分含量最高。CBPs粗蛋白含量最少，且与其余3种畜禽骨蛋白肽差异显著（P＜0.05）。脂肪含量虽是影响畜禽骨蛋白肽整体口感的重要因素，但含量均极少。CBPs灰分含量最高，且与其余3种畜禽骨蛋白肽差异显著 （P＜0.05）。畜禽骨蛋白肽中多肽含量高，而水分和灰分含量较少且对呈味没有直接影响，因而畜禽骨蛋白肽滋味差异的主要物质基础可能为蛋白质、多肽以及游离氨基酸组成及含量[35]。

表2 4种畜禽骨蛋白肽的基本营养成分分析Table 2 Nutrient components of bone peptides from different animal species%

2.1.2 畜禽骨蛋白肽氨基酸组成分析

氨基酸参与多种生理活动，是维持机体正常代谢的必需营养物质之一，同时也是一种重要的滋味成分，可通过α-NH+和γ-COO-基团之间的静电吸引形成五元环结构而呈味[36]，氨基酸之间以及氨基酸与肌苷酸等其他成分之间还存在相互协同作用，按呈味特征将游离氨基酸分为鲜味、甜味、苦味3 组。

如表3所示，畜禽骨蛋白肽中检出17种氨基酸，色氨酸因酸性条件受到破坏、谷氨酰胺及天冬酰胺因脱酰胺基而未检出。游离氨基酸总量以及鲜味、甜味、苦味氨基酸含量在4种畜禽骨蛋白肽中均具有一定差异，但整体均表现为甜味氨基酸含量最高，其次为苦味、鲜味氨基酸。各氨基酸的呈味阈值各不相同，鲜味氨基酸虽然含量最低，但其呈味阈值也较低，因而对总体滋味的增强作用通常较强。CBPs的鲜味、甜味氨基酸含量与其余3种畜禽骨蛋白肽差异较显著（P＜0.05）。

表3 4种畜禽骨蛋白肽的中游离氨基酸组成及含量Table 3 Free amino acid composition of bone peptides from different animal species

2.2 基于电子舌检测的畜禽骨蛋白肽滋味特征分析

2.2.1 电子舌检测对畜禽骨蛋白肽的响应信号曲线

图1显示电子舌味觉传感器对畜禽骨蛋白肽的响应强度，表明4种畜禽骨蛋白肽的滋味特征接近。味觉传感器的响应强度均为SCS（对苦味敏感）＞ANS（对甜味敏感）＞PKS（通用传感器）＞NMS（对鲜味敏感）＞CTS（对咸味敏感）＞CPS（通用传感器）＞AHS（对酸味敏感）。0～5 s内传感器响应强度发生显著变化，10 s后趋于平衡，说明电子舌用于分析样品滋味物质强度时具有良好的稳定性，选取每个传感器在120 s的稳定滋味数值。

图1 电子舌传感器对畜禽骨蛋白肽的响应信号曲线Fig. 1 Response curves of electronic tongue sensors to bone peptides from different animal species

2.2.2 畜禽骨蛋白肽的滋味特征及差异分析

电子舌分析系统基于传感器的响应信号强度得到4种畜禽骨蛋白肽的滋味强度，进一步分析畜禽骨蛋白肽的滋味特征以及种间滋味差异。

表4的滋味强度分析结果表明，畜禽骨蛋白肽在酸、甜、苦、咸、鲜5种基本味觉强度上均存在差异。其中，鲜味的差异相对最为明显，这可能是由于鲜味氨基酸呈味阈值低。表5的种间滋味差异分析显示，4种畜禽骨蛋白肽两两之间均具有显著滋味差异（P＜0.01）。其中，PBPs和CBPs之间的距离和模式识别指数均最大，表明PBPs和CBPs之间滋味特征差异最大。

表4 4种畜禽骨蛋白肽的滋味强度Table 4 Evaluation of taste characteristics of bone peptides from different animal species

表5 4种畜禽骨蛋白肽滋味差异分析Table 5 Analysis of taste differences between bone peptides from different animal species

2.2.3 畜禽骨蛋白肽滋味的雷达指纹图谱

由图2可知，4种畜禽骨蛋白肽在SCS、NMS和PKS传感器上的响应强度存在差异，在AHS、ANS、CTS、CPS传感器上的响应强度无明显差异，表明畜禽骨蛋白肽在鲜味、苦味属性上差异较显著，酸味、咸味、甜味差异不显著。电子舌具备根据滋味物质差异而判别不同物种畜禽骨蛋白肽的潜力。

图2 畜禽骨蛋白肽滋味的雷达指纹图谱Fig. 2 Radar fingerprints of taste of one peptides from different animal species

2.3 畜禽骨蛋白肽滋味差异的多元统计分析

2.3.1 PCA

将电子舌传感器提取的多指标数据信息进行降维转换得到特征向量并进行线性分类，在转换中得到的PC1和PC2的贡献率越大，说明降维后的综合指标可越好地反映原来多指标的信息。

图3中每个多边形代表一种畜禽骨蛋白肽的整体滋味特征，多边形之间的距离代表畜禽骨蛋白肽种间的整体滋味差异。PC1和PC2的贡献率分别为86.019%和11.266%，两者累计贡献率达97.285%，判别指数为64，表明PC1和PC2包含了原始数据的大多数信息，能够反映样品的整体信息。畜禽骨蛋白肽种间较明显地分为互不干扰的4个区域，BBPs和PBPs之间差异相对较小。PCA结果表明，基于电子舌滋味检测对不同物种畜禽骨蛋白肽的定性判别效果良好。

图3 畜禽骨蛋白肽滋味的PCA图Fig. 3 PCA plot of taste of bone peptides from different animal species

2.3.2 PLS-DA和OPLS-DA

PLS-DA是常见的数据分类方法，对数据降维并进行线性拟合建立回归模型，而OPLS-DA是在PLS-DA的基础上进行正交变换矫正，滤除与分类信息无关的噪音以获得更好的组间分离效果。如图4A1、B1所示，PLS-DA 模型的R2Y=0.847、Q2=0.524，表明模型对变量Y的解释率为84.7%，且Q2＞0.50，说明模型拟合度较好，预测能力高；由置换检验结果可知，R2的截距为0.294，Q2的截距为-0.802，表明模型预测能力良好、有效可用，且不存在过拟合。变量投影重要性值（variable importance in projection，VIP）的结果（图4C1）表明，NMS、ANS为主要差异因素（VIP＞1），即鲜味、甜味对4种畜禽骨蛋白肽判别的贡献较大，与电子舌滋味分析的结果一致。表明PLS-DA可对CBPs、YBPs、BBPs和PBPs进行良好判别，但对于BBPs和PBPs的判别效果不理想，故对两者进一步作OPLS-DA分析。如图4A2、B2所示，OPLS-DA模型R2Y=0.991、Q2=0.841，表明模型对分类变量Y的解释率为99.1%，且Q2＞0.50，说明模型的预测效果好；由置换检验结果可知，R2截距为0.347，Q2截距 为-0.639，表明模型的预测能力高且稳定性良好。VIP值的结果（图4C2）显示，NMS、CPS、ANS是BBPs和PBPs滋味差异的主要因素，即鲜味、甜味对BBPs与PBPs的判别贡献较大。

图4 不同物种畜禽骨蛋白肽的PLS-DA及OPLS-DA分析结果Fig. 4 PLS-DA and OPLS-DA scores of bone peptides from different animal species

以上结果表明，鲜味、甜味、苦味为不同物种畜禽骨蛋白肽的主要滋味差异，建立的PLS-DA模型可对CBPs、YBPs、BBPs和PBPs进行良好判别，OPLS-DA模型可进一步判别BBPs、PBPs，PLS-DA和OPLS-DA模型拟合效果和稳定性好、预测能力高，表明基于电子舌检测结合多元统计分析根据滋味特征差异判别不同物种畜禽骨蛋白肽具有较好的灵敏度和稳定性。

2.3.3 Fisher判别模型

Fisher判别分析是一种用于判别样本归类的多元线性分析方法，是将n维向量x=（x1,x2, ···,xn）投影到m个线性函数组合y1=a1x,y2=a2x, ···,ym=amx（m＜n）进行降维，同时依据组间均方差与组内均方差之比最大的原则使不同类别离差最大而同类别离差最小，依据y1,y2, ···,ym判定样品类别。从电子舌检测产生的28 组数据中随机选取12 组作为训练集，其余16 组为测试集，建立Fisher判别模型，观察值为AHS、PKS、CTS、NMS、CPS、SCS、ANS 7根传感器响应值。在Fisher判别分析中，若样本分类有f种，样本特征指标有g个，一般需建立（f-1）个包含样本所有g个指标的判别函数模型。本研究中畜禽骨蛋白肽样本为4种，因此建立3个典则判别函数模型，分别记为Y1、Y2、Y3。分析得到不同物种畜禽骨蛋白肽的典则判别函数为：

根据测试集和训练集数据的代入结果，若Y1、Y2、Y3均大于0，则属于PBPs；若Y1＜0且Y2、Y3均大于0，则对应属于YBPs、BBPs、CBPs。将测试集数据代入判别方程，判别结果显示判断正确的样本数为11，判断错误的样本数为5，判别正确率为68.8%，这表明Fisher判别函数对4种畜禽骨蛋白肽具备一定的判别能力，但判别能力相对不显著（一般要求判别正确率大于0.8），样本误判的原因可能是畜禽骨蛋白肽的整体滋味特征非常接近或实验误差所致。

由表6可知，3个典则判别函数的特征值分别为20.560、4.366、0.618，方差累计100%，典则相关系数分别为0.977、0.902、0.618，这与解释方差的比例吻合。典则判别函数的特征值表示函数组间平方和与组内平方和之比，特征值越大表明函数的判别效果越好，典则相关系数则表示典则判别函数与组别间的关联程度。可见，典则判别函数Y1的判别能力和各组间的关联程度最高，Y2良好，而Y3则较差。Λ统计量是用于描述Fisher判别模型的有效性检验结果和函数的判别能力，该检验的原假设是认为不同组的Fisher判别函数平均值不存在显著差异，即认为典则判别函数是无效的且判别能力不显著。由表7可知，典则判别函数Y1在0.05的显著性水平下拒绝原假设，即典则判别函数Y1的判别能力相对较显著（P＜0.05），而Y2和Y3在0.05的显著性水平下接受原假设，即典则判别函数Y2和Y3的判别能力相对不显著（P＞0.05）。

表6 Fisher判别函数特征值Table 6 Eigenvalues of Fisher discriminant functions

表7 Fisher判别函数的Λ统计量Table 7 Λ statistics of Fisher discriminant functions

2.3.4 DFA

DFA是针对传感器数据进行优化重组，从而使组间距离最大同时保证组内差异最小以提高样品间区分度的分类技术。

由图5可知，DF1和DF2的贡献率分别为75.100%和23.883%，累计贡献率达98.983%，前2个主成分包含了原始数据的绝大部分信息。4种畜禽骨蛋白肽样本组内分布集中、离散度小，样本组间分布距离远、离散度大。表明电子舌检测结合DFA对4种畜禽骨蛋白肽样本的判别效果好、灵敏度高。

图5 畜禽骨蛋白肽滋味的DFA图Fig. 5 DFA plot of taste of bone peptides from different animal species

2.4 电子舌检测结合多元统计分析的应用及比较

电子舌检测结合PCA、DFA、PLS-DA、OPLS-DA、Fisher判别分析等多元统计分析方法，可量化滋味特征差异，良好判别4种畜禽骨蛋白肽，且DFA判别能力更显著。PCA是无监督的分类技术，通过正交变换旋转数轴将一组可能存在相关性的变量降维转换为一组线性不相关的变量，而后进行线性分类得到一组新的数轴以捕捉数据集间的最大差异。而DFA需要先验知识以优化重组数据的区分性，使得组间数据重心距离最大的同时保证组内差异最小，因此其判别效果一般优于PCA。PLS-DA通过将自变量和因变量数据集之间的协方差最大化来构建正交得分向量，同时拟合自变量和因变量数据之间的线性关系建立回归模型，然后利用一定的判别阈值对回归结果进行判别分析，从而较PCA能更高效地提取组间变异信息。OPLS-DA则是在PLS-DA的基础上使用正交变换矫正将X矩阵信息分解成与Y相关和不相关的两类信息，然后滤除与分类无关的信息并将相关的信息主要集中在第1个预测成分，更适用于分析两组间的变异信息，OPLS-DA能够保持模型预测能力，有效减少模型的复杂性和增强模型的解析能力，因此更能体现与实验条件有关的样品差异，相较于PCA和PLS-DA能使组间样本的分离效果更佳。

总之，本研究结果表明，电子舌滋味检测结合多元统计分析根据滋味特征差异能够有效判别不同物种畜禽骨蛋白肽，且DFA模型的判别效果最佳。

3 结 论

电子舌检测简便高效、重复性好，是一种很有前景的味觉分析手段[37]。本研究以16 份畜禽骨蛋白肽为原料，电子舌采集滋味特征数值，结合PCA、PLS-DA、OPLS-DA、DFA等多元统计分析方法对不同物种畜禽骨蛋白肽的滋味特征进行判别分析，同时初步构建了Fisher判别模型以判别鉴定不同物种畜禽骨蛋白肽，探究基于电子舌滋味特征检测判别不同物种畜禽骨蛋白肽的可行性。结果表明，通过PCA和DFA均可良好的判别4种畜禽骨蛋白肽，但DFA明显优于PCA；PLS-DA可有效判别CBPs、YBPs、BBPs和PBPs，OPLS-DA可有效判别BBPs、PBPs。建立的Fisher判别分析模型可有效判别PBPs和YBPs、BBPs、CBPs，但对后三者的判别效果不够理想，模型判别的正确率为68.8%。鲜味、甜味、苦味是4种畜禽骨蛋白肽的主要差异滋味特征。综上，电子舌滋味检测结合多元统计分析能够为不同物种畜禽骨蛋白肽的判别鉴定提供了一种快速、有效的分析检测手段。