模仿葡萄球菌接种对发酵香肠品质及氧化稳定性的影响

冯美琴，张 杰，孙 健,*

（1.金陵科技学院动物科学与食品工程学院，江苏 南京 210038；2.南京农业大学食品科技学院，国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏 南京 210095）

发酵香肠具有非常独特的色泽和风味，因此受到消费者的青睐。蛋白质和脂肪不仅是发酵香肠的重要组成部分还会影响其感官特性。在发酵剂作用下，肉中脂肪、蛋白质氧化降解生成风味化合物和小肽等物质[1]。蛋白质适度氧化降解会生成游离氨基酸和小肽等，但是蛋白质的过度氧化降解会使产品的质地、风味等发生劣变，降低消化率和营养价值[2]。脂肪氧化先产生酯、醇和醛等小分子挥发性物质，这些物质还能够继续参与非酶促褐变反应，这使得发酵香肠形成其独特风味，但脂肪的过度氧化会使香肠风味、色泽等多方面品质劣变，货架期变短，产品商业价值变低[3]，甚至产生多种有害物质，危害人体健康[4-5]。因此，为更好地控制发酵肉制品的品质，接种外源发酵剂是一种有效方法。

目前，血浆凝固酶阴性葡萄球菌是用作肉制品发酵剂的重要微生物之一。但是中西式发酵香肠中的优势葡萄球菌具有差异性。欧洲传统发酵香肠[6-7]中具有优势的葡萄球菌种类一般有腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、木糖葡萄球菌（S. xylosus）、肉葡萄球菌（S. carnosus）、马胃葡萄球菌（S. equorum）；而在中式发酵肉制品[8]中更具有优势的葡萄球菌一般有表皮葡萄球菌（S. epidermidis）、松鼠葡萄球菌（S. sciuri）、模仿葡萄球菌（S. simulans）等。葡萄球菌作为发酵剂应具备良好的蛋白酶和脂肪酶活性及硝酸盐还原酶活性，还需赋予发酵香肠独特的风味和色泽[9]。因此接种葡萄球菌既促进了发酵香肠色泽的形成，又降低了亚硝酸盐及致癌物亚硝胺的含量[10]；它们还具有过氧化氢酶活性，可以促进H2O2分解，抑制过氧化物的产生。也有报道[11-13]称，葡萄球菌在发酵香肠的风味形成过程中起重要作用，这是因为葡萄球菌的生长代谢作用可以转化肉中的碳水化合物、氨基酸和脂肪酸，产生一系列挥发风味物质，从而促进发酵香肠风味的形成。

本研究旨在探究实验室从传统中式香肠中筛选出的具有高蛋白酶活性且符合肉品发酵剂标准的S. simulansNJ201对发酵香肠的影响。S. simulansNJ201已经过较全面的安全风险评估[14]（具体为血浆凝固酶、溶血、DNase均为阴性，不产生物膜、具有抗生素敏感性、不具有毒力因子，急性毒性试验显示无毒）。以接种S. simulansNJ201的发酵香肠为实验组，自然发酵香肠为对照组，探究S. simulansNJ201作为发酵剂对发酵香肠氧化稳定性和品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

S. simulansNJ201（NCBI编号MG798671）由本实验室从传统中式香肠中分离得到[14]。

猪瘦肉、猪肥膘、香肠肠衣 江苏省苏果超市有限公司；葡萄糖 河南晟发生物科技有限公司；亚硝酸钠 杭州龙山化工有限公司；异抗坏血酸钠 诸城华源生物工程有限公司；盐 中国盐业集团有限公司；白砂糖 太古糖业有限公司；姜粉、五香粉等调味品 市售。

蛋白质羰基含量检测试剂盒、蛋白质总巯基含量检测试剂盒、丙二醛含量检测试剂盒 北京索莱宝生物有限公司；淀粉指示剂 上海源叶生物科技有限公司；碘化钾、硫代硫酸钠标准滴定液 国药集团化学试剂有限公司；实验所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

KBF 240恒温恒湿箱 德国Binder公司；Testo 205 pH计 德图仪器有限公司；TA.XT质构仪 英国Stable Micro System公司；CR-400色差仪 日本柯尼卡美能达公司；Avanti J-E离心机 美国贝克曼库尔特公司； M2e多功能酶标仪 德国IKA公司；7890A-5975C气相色谱-质谱仪 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵剂的活化与制备

参照曹辰辰等[14]方法，用MSA培养基培养S. simulansNJ201（37 ℃、24 h），活化3 次后离心（4 ℃、6 000 r/min、10 min），弃上清液，用无菌生理盐水洗涤3 次，重悬，菌悬液保留备用。

1.3.2 发酵香肠的制作

参照曹辰辰等[14]发酵香肠制作的方法。每份香肠由瘦肉与肥膘组成（质量比8∶2），发酵剂接种量107CFU/g。 香肠辅料用量以肉质量为基础，分别添加食盐2%、葡萄糖1%、白砂糖1%、异抗坏血酸钠0.05%、亚硝酸钠0.015%、姜粉0.1%、白胡椒粉0.1%、五香粉0.1%。实验分为：对照组（CK组），自然发酵；实验组（LC组），接种S. simulansNJ201发酵。

制作流程：挑选原料肉、洗涤、绞碎原料肉、腌制肉馅、搅拌均匀、灌肠、发酵、干燥成熟。

工艺要点：第1天发酵条件为温度30 ℃、相对湿度80%；第2～4天发酵条件为温度15 ℃、相对湿度75%；第5～21天发酵条件为温度12 ℃、相对湿度72%。

1.3.3 pH值测定

按照GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》[15]，用pH计进行测定。

1.3.4 色差测定

将去除肠衣的香肠绞碎，压成薄片后用色差仪测定其亮度值（L*）、红度值（a*）、黄度值（b*）。测定前需校正。由于b*在很大程度上会影响a*，因此引入E*评判香肠的色泽减小误差，E*=a*/b*+a*/L*[16]，E*表示3种颜色指标变化的综合贡献。

1.3.5 质构测定

去除肠衣，将香肠切成厚2.5 cm、直径约2.0 cm的薄片。测试参数：探头型号P/50，测前速率2.0 mm/s，测试速率2.0 mm/s，测后速率5.0 mm/s，压缩比50%。每组香肠重复测定3 次，每次重复实验中选取6个不同位置进行测定。

1.3.6 过氧化值（peroxide value，POV）测定

按照GB 5009.227—2016《食品中过氧化值的测定》[17]进行。

1.3.7 硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值测定

按试剂盒说明书操作，TBARS值表示为每克肉样所含丙二醛含量（nmol/g）。

1.3.8 羰基含量测定

按试剂盒说明书操作，结果表示为每克肉样所含羰基含量（nmol/g）。

1.3.9 总巯基含量测定

按试剂盒说明书操作，结果表示为每克肉样所含巯基含量（μmol/g）。

1.3.10 挥发性风味物质测定

参照曹辰辰等[14]的方法并适当修改。采用固相微萃取法进行样品处理。在20 mL顶空瓶中装入5 g样品后压盖，萃取头型号为60 μm PDMS/DVB，将老化后的萃取头插入顶空瓶，60 ℃吸附30 min，吸附后的萃取头插入气相色谱进样口，250 ℃解吸3 min，同时启动仪器采集数据。

色谱条件：TR-5 MS毛细管柱（30 m×0.25 mm， 0.25 μm），以氦气为载气，流速1 mL/min。升温程序：40 ℃保持3 min，以2 ℃/min的速率升温至70 ℃，保持0.5 min，以4 ℃/min的速率升温至180 ℃，保持0.5 min，再以10 ℃/min的速率升温至280 ℃，保持5 min。质谱条件：离子源温度200 ℃，电离方式电子电离，正离子模式，电子能量70 eV，发射电流120 μA，扫描质量范围m/z30～550。使用峰面积归一法计算每种风味化合物的相对含量。

1.4 数据处理

每个处理进行3 次重复。采用SAS 8.0软件分析数据，采用方差分析和Duncan多重比较进行差异显著性分析；P＜0.05，差异显著；用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对发酵香肠pH值的影响

由图1可知，接种发酵对pH值影响显著 （P＜0.05）。随发酵时间延长，两组香肠的pH值均先下降后上升。发酵1 d，LC组的pH值降至5.30，显著低于CK组的5.40（P＜0.05），表明接种S. simulansNJ201能够显著降低pH值（P＜0.05），保证香肠的食用安全性。发酵4 d，CK、LC两组香肠pH值均降至最低，分别为5.35、5.15。在随后的干燥成熟过程中pH值又逐渐上升，发酵21 d，CK、LC两组香肠pH值均升至最高值，分别为5.93、5.76。在整个发酵及成熟过程中，LC组pH值降低程度优于CK组，这是因为S. simulans能够代谢碳水化合物，并将其转化为有机酸（主要是乳酸和醋酸）[18]。

图1 不同处理对发酵香肠pH值的影响Fig. 1 Effect of different fermentation treatments on pH of fermented sausages

2.2 不同处理对发酵香肠色差的影响

如表1所示，L*和E*均受发酵时间显著影响 （P＜0.05），L*受处理方式影响较E*更大。随发酵时间的延长，两组香肠L*均逐渐降低，L*下降和加工过程中水分的散失有极大关系[19]；两组香肠的E*逐渐增加，尤其第21天时，LC组的E*达到2.91，显著高于CK组2.17（P＜0.05）。研究表明S. simulans中硝酸盐还原酶活性强[18]，可将肉制品中的NO3-还原为NO2-，并进一步分解为NO，促进发色，使该组的a*和E*偏大，这有利于发酵香肠独特色泽的形成；而CK组因未接种S. simulans只有内源微生物作用，发色效果没有LC组理想，使得该组的a*偏小，导致E*偏小[20]。

表1 不同处理对发酵香肠色差的影响Table 1 Effect of different fermentation treatments on color parameters of fermented sausages

2.3 不同处理对发酵香肠质构的影响

优良的发酵香肠硬度适宜、肠体紧实有弹性。如 表2所示，发酵21 d，LC组的硬度和咀嚼性显著高于CK组（P＜0.05），这表明接种S. simulans能提升产品的硬度和咀嚼性，这与张聪等[21]的研究一致。在香肠发酵、成熟过程中，pH值降低、水分含量减少、脂肪和蛋白质氧化等因素都可以增大香肠的硬度、内聚性和咀嚼性。姜蕾等[22]发现，肉制品在加工及贮藏期间硬度的增加是由于乳化体系的不稳定导致水分、脂肪从蛋白质基质中分离；杜智慧[23]研究发现，发酵剂影响香肠的质构特性，是由于发酵作用能降低香肠pH值至蛋白质等电点，促进蛋白质凝胶化，使发酵香肠的硬度、内聚性和咀嚼性增加。

表2 不同处理对发酵香肠质构的影响Table 2 Effect of different fermentation treatments on textural properties of fermented sausages

2.4 不同处理对发酵香肠POV的影响

POV能够表征脂肪初级氧化产物氢过氧化物的 含量[14,24]。香肠在发酵及成熟过程中，由于内源脂肪酶的存在，脂肪易发生大量降解。不饱和脂肪酸易被氧化为氢过氧化物，使得香肠的POV快速升高[25]。

如图2所示，随发酵时间延长不同处理组的POV均增大，证明两组香肠脂肪氧化程度随发酵时间的延长而不断加剧，这与曹辰辰等[14]的研究结果一致。由分析可知，POV受发酵时间、处理方式影响显著（P＜0.05）。发酵1 d，两组香肠的POV均较低；在之后的发酵过程中，两组香肠的POV均不断增大，且CK组增速更快，这可能是CK组中脂肪氧化产物的分解速率小于生成解速率导致。第21天时，CK、LC组POV分别增加到35.35、26.95 mg/100 g。

图2 不同处理对发酵香肠POV的影响Fig. 2 Effect of different fermentation treatments on POV of fermented sausages

卢士玲[26]研究发现，变异微球菌与肉糖葡萄球菌具有能分解过氧化物的过氧化氢酶，且活性较强，过氧化氢酶能抑制POV的增大。LC组的POV始终低于CK组，这可能是因为LC组接种了S. simulans，S. simulans具有过氧化氢酶活性，能抑制香肠的脂肪氧化。

2.5 不同处理对发酵香肠TBARS值的影响

TBARS值能够评判脂质次级氧化程度，而脂肪次级氧化产物丙二醛的含量越高，TBARS值越大，脂质氧化程度越深[27]。由图3可知，TBARS值受发酵时间与处理方式影响显著（P＜0.05）。两组香肠的TBARS值均随发酵时间的延长而增大。这是因为随着脂肪氧化程度的加深，丙二醛不断积累，因此TBARS值也随之增大。发酵1 d，CK、LC组的TBARS值均较小，分别为4.04、3.86 nmol/g。在整个发酵过程中，CK组的TBARS值始终高于LC组，尤其在发酵21 d，CK与LC组的TBARS值的差值达到最大，为4.84 nmol/g。

图3 不同处理对发酵香肠TBARS值的影响Fig. 3 Effect of different fermentation treatments on TBARS value of fermented sausages

张大磊等[28]研究发现，接种发酵使广式腊肠具有更低的TBARS值，这是因为该实验中使用的葡萄球菌H33B及微球菌X142B具有高蛋白酶活性，能够抑制丙二醛的生成；另一方面葡萄球菌中过氧化氢酶活性较强，能够分解氧化反应进程中生成的H2O2，减缓脂肪的氧化。本研究结果与其相似，说明S. simulans的蛋白酶活性较强，且能够产生过氧化氢酶，从而抑制脂肪氧化。

2.6 不同处理对发酵香肠羰基含量的影响

氨基酸侧链及肽键断裂，二硫键与其作用导致蛋白质交联都能够生成羰基，从而导致蛋白质功能特性 降低[29]。以上氧化效应均能影响肉品的接受度，使产品贮藏时间变短[30]。由图4可知，发酵时间和处理方式对羰基含量均影响显著（P＜0.05）。两组香肠的羰基含量均随发酵时间的延长而增大，表明香肠中的蛋白质氧化程度随发酵时间的延长而加深；到第21天时，CK、LC组的羰基含量及差值都达到最大值，羰基含量分别为50.35、42.54 nmol/g，差值为7.81 nmol/g。这与张大磊等[28]的研究结果相似，接种发酵使广式腊肠具有更低的羰基含量，这可能是因为某些脂质自由基和初期脂肪氧化产物会对某些特定氨基酸残基的降解有一定影响，从而导致蛋白氧化。因此抑制脂肪氧化的同时也可以抑制蛋白氧化。从发酵到成熟的整个过程，LC组的羰基含量始终低于CK组，这表明接种S. simulansNJ201能够抑制香肠中蛋白质氧化。

图4 不同处理对发酵香肠羰基含量的影响Fig. 4 Effect of different fermentation treatments on protein carbonyl content of fermented sausages

2.7 不同处理对发酵香肠总巯基含量的影响

肌肉蛋白被氧化的另一个标志是半胱氨酸残基氧化，引起巯基被氧化成二硫键等，从而降低了巯基含量[31]。 如图5所示，总巯基含量受发酵时间和处理方式影响显著（P＜0.05）。随着发酵时间延长，两组香肠的总巯基含量均下降。发酵1～4 d，两组香肠的总巯基含量下降速率均较慢，这可能是因为香肠刚发酵不久，蛋白质氧化程度较低；发酵4～9 d，CK组的总巯基含量下降 0.97 μmol/g，而LC组的总巯基含量下降了0.83 μmol/g； 第21天时，CK、LC组的总巯基含量均降至最低，分别为0.23、0.68 μmol/g，此时LC组显著高于CK组 （P＜0.05），这表明S. simulans在一定程度上能够抑制蛋白质氧化，与羰基结果具有一致性。

图5 不同处理对发酵香肠总巯基含量的影响Fig. 5 Effect of different fermentation treatments on total sulfhydryl content of fermented sausages

2.8 不同处理对发酵香肠挥发性风味物质的影响

由表3、4可知，两组香肠共检出124种挥发性化合物，主要为酯类、碳氢、醇类等化合物。CK、LC组分别检出104种和116种挥发性化合物，LC组中的风味物质种类及含量（除醛类）一般高于CK组。两组香肠中含量最高的风味物质都是酯类，其次是碳氢化合物，LC组达到了26.43%，显著高于CK组（P＜0.05）。CK、LC组的酸类物质相对含量分别为2.23%、3.84%，酸类化合物含量较低，这与王萧等[32]的研究结果相似。

表3 不同处理组香肠中挥发性风味物质的比较Table 3 Comparison of volatile flavor compounds of fermented sausages with different treatments

本研究LC组的大多数酯类含量都高于CK组，而发酵香肠的典型风味主要来源于酯类，这表明接种S. simulans能够促进发酵香肠风味的形成[18]。多数酯类化合物通常具有芳香味，由短链脂肪酸形成的酯类大多带有水果香气，由长链脂肪酸形成的酯类大多呈现较淡的油脂味[14]，其中丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和戊酸乙酯气味极强[34]。脂肪水解产生的游离脂肪酸会与醇反应生成酯类物质，这也对香肠的独特风味具有重要贡献[33]。LC组中丁酸乙酯、丙酸乙酯等酯类含量均高于CK组，它们大多都具有花果香、焦糖及烤肉香味等，这也说明接种S. simulans有利于发酵香肠风味的形成。本实验中含量次多的挥发性风味物质为碳氢化合物，且LC组中碳氢化合物的含量显著高于CK组（P＜0.05）。脂肪氧化会产生烷烃化合物，产品制备中加入的香辛料是烯烃化合物重要来源之一。芳香烃化合物可能来自于芳香族氨基酸的降解，也可能来自于制作时添加的调味料，这能赋予发酵香肠烟熏味及香肠的独特味道。

醛类化合物阈值低，主要来源于油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸的氧化以及氨基酸降解，是发酵香肠中重要的风味化合物[14,35]。其中含量最高的是己醛，具有青草味，能够反映脂肪的氧化程度[36]，CK组的己醛含量显著大于LC组（P＜0.05），这也能表明CK组的脂肪氧化程度大于LC组。苯甲醛、苯乙醛都具有清新味及香料味；(E)-2-庚烯醛具有烧烤及黄油味[37]，这些物质对发酵肉制品特殊风味的形成具有重要贡献。醇类化合物没有被认定为重要的香气贡献者，这是因为醇类物质具有较高的阈值[38]。LC组的酮类物质相对含量显著高于CK组 （P＜0.05），而酮类化合物能够促进奶香味生成，这也表明模仿葡萄球菌可以促进香肠风味的形成。3-羟基-2-丁酮具有黄油味，是两组香肠测得相对含量最高的酮类化合物，其对发酵香肠的风味形成具有重要意义。

表4 不同处理组香肠中挥发性风味物质的相对含量Table 4 Relative contents of volatile flavor compounds in fermented sausages with different treatments

续表4

续表4

3 结 论

本实验以接种S. simulansNJ201制作发酵香肠为实验组，自然发酵香肠为对照组，通过对比物理指标、脂肪和蛋白氧化及挥发性风味物质种类和含量，探究接种S. simulans对发酵香肠品质及氧化稳定性的影响。结果表明，LC组发酵香肠发酵1 d的pH值降至5.30以下具有食用安全性；与CK组相比，LC组的E*、硬度、咀嚼性等指标均显著提高（P＜0.05），接种发酵香肠的色泽与口感得到了改善，食用品质有所提高；LC组的POV、TBARS值及羰基含量较CK组均显著降低（P＜0.05），而总巯基含量显著提高（P＜0.05），LC组发酵香肠的脂肪和蛋白质的氧化进程被抑制；LC组的挥发性风味物质种类及含量较CK组有所提升，LC组中大多数酯类、酮类含量都高于CK组，而酯类及酮类化合物对发酵香肠的典型风味形成具有重要贡献，接种S. simulansNJ201在一定程度上促进了发酵香肠风味的形成，这都有利于提升发酵香肠的产品价值。

综上，本实验初步证明S. simulansNJ201能够改善发酵香肠的品质，提高其氧化稳定性，可以作为发酵剂应用于发酵香肠的生产。