风轮菜染色体数目及核型分析

杨东娟，陈春意，王顺安

（韩山师范学院 生命科学与食品工程学院，广东 潮州 521041）

风轮菜Clinopodium chinense（Benth.）O.Kuntze 又名熊胆草、苦地胆、九层塔等，民间又称为神仙草.为唇形科风轮菜属多年生草本植物，生于海拔1 000 m 以下的山坡、草丛、路边、灌丛或林下［1］.风轮菜属植物约有20 种，分布于欧洲、中亚和亚洲东部.我国共有11 种、5 个变种和1 个变型［2］，主要分布于江苏、江西、湖南、广东、云南等地.该属植物具有收敛止血之功效，多为民间用药，主要用于治疗崩漏、尿血、鼻衄、牙龈出血、创伤出血等出血症及单纯性紫癜、原发性血小板减少性紫癜等症［3］.也作为菜肴食用，深受人们喜爱［4］.

风轮菜的营养成分丰富，含有大量的微量元素、氨基酸、多糖、总黄酮等成分.对风轮菜的现有研究主要集中在其化学成分、药理、食用功能等方面，但至今未见有关风轮菜染色体等遗传信息方面的研究报道.因此，本实验首次对风轮菜进行染色体数目与核型研究，为更好地研究开发风轮菜资源及其进化、遗传育种等方面提供一定的细胞学依据.

1 材料和方法

1.1 材料

风轮菜采自潮州市湘桥区慧如公园，取其茎段扦插，一周后长出根系.

1.2 实验试剂与仪器

0.002 mol/L 8-羟基喹啉溶液、Carnoy 固定液（甲醇∶乙酸=3∶1）、纤维素酶、果胶酶、磷酸缓冲液（pH=7.2）、Giemsa 染液；FA2004N 型电子分析天平、Olympus CX31RTSF 型光学显微镜、Canon Power Shot G12型数码相机.

1.3 实验方法

待扦插的风轮菜根长至1 cm 左右，于上午8∶00-10∶30时取其带根冠的健康根尖约0.5 cm 长，放入预冷的浓度为0.002 mol/L的8-羟基喹啉溶液4 ℃低温处理2-5 h，蒸馏水清洗后转入固定液（甲醇∶乙酸=3∶1）固定12 h以上，然后按照Zhuang［5］所用酶解方法制片：将根尖用4%纤维素酶与1%果胶酶混合酶液酶解1.5 h左右，蒸馏水低渗20 min后将根尖放置在干净的载玻片上，用镊子夹取固定液迅速捣碎使细胞分散［6-7］，酒精灯略微过火，过夜晾干后用Giemsa染液扣染30 min.显微镜下观察，拍照.选取50个染色体数目明确、形态清晰的中期分裂相，进行染色体计数，以确定其数目和倍性.

1.4 核型分析

选取3 个染色体数目和形态清晰的分裂相细胞进行核型分析，按照染色体的大小和形态特征对其进行分组、排序以及同源染色体的配对.测量染色体的长臂和短臂值，并根据公式计算染色体的相对长度（染色体相对长度=每条染色体长度/染色体组总长度×100%）、染色体不对称系数（染色体不对称系数=染色体长臂总长度/染色体组总长度×100%）、相对长度系数（相对长度系数=每条染色体的相对长度/染色体的平均相对长度）和臂比（臂比=长臂/短臂）.参照李懋学［8］的标准进行染色体核型分析，参照Levan等［9］对染色体类型的分类系统确立核型公式，参照Stebbins［10］对核型类型的分类标准确定染色体核型类型，参照Arano［11］的方法计算核型不对称系数.采用Photoshop CS6 制作染色体核型图的和测量数据，用Microsoft Office Excel 软件进行数据处理和与修图工具相结合制作染色体核型模式图［12］.

2 结果与分析

2.1 风轮菜染色体数目

根据李懋学和陈瑞阳提出的理论，当85%以上的细胞具有恒定一致的染色体数目时，即可认为是该植物的染色体数目［8］.本实验观察了50 个风轮菜根尖细胞的有丝分裂中期相，其中有44 个细胞的染色体数为66 条，占计数细胞的88%，有4 个细胞染色体数为65 条，2 个细胞染色体数为64 条，因此，确定风轮菜染色体数目为2n=2x=66，体细胞为二倍体，染色体基数为x=33.在观察中没有发现多倍体，也没有发现B染色体的存在，见图1.

图1 风轮菜染色体数目及核型图

2.2 风轮菜染色体长度组成及核型分析

2.2.1 风轮菜核型公式的确定

选取3个染色体形态清晰、分散良好的染色体图像（图1），进行分析、配对和测量，取其平均值.根据染色体相对长度公式计算出每对染色体的相对长度，详细参数见表1.由表1可以看出，风轮菜33对染色体中臂比值为1.00 的染色体有2 对，臂比值在1.01-1.70 之间的有31 对，根据以上数据，可以确定风轮菜的染色体核型公式为K=2n=2x=62m+4M［13］.

2.2.2 风轮菜染色体核型图的制作

参照杨大翔［14］的方法对同源染色体配对，并用Excel软件处理表1中所列各染色体数据，用Adobe Photoshop CS6软件处理图片并制作染色体核型图，（见图2）.

图2 风轮菜核型模式图

表1 风轮菜的染色体参数

2.2.3 风轮菜核型分类

由表1 可知风轮菜染色体绝对长度总长为1.362 9 μm，平均绝对长度为0.020 65 μm，染色体长臂绝对长度总长0.732 0 μm.根据染色体不对称公式计算出风轮菜染色体的不对称系数为53.71%，因此其对称程度较高.根据Stebbins［10］的“不对称核型分析”分类的12 种类型，最长染色体和最短染色体的比值为2.07，没有臂比大于2∶1的染色体，风轮菜染色体核型属于“1B”型，为基本对称染色体核型.风轮菜的染色体相对长度系数组成为2n=66=2L+30M2+30M1+4S，染色体的相对长度差异不是很大.

3 讨论和结论

目前，对风轮菜染色体数目及核型分析的研究还未见报道.本研究通过对风轮菜染色体的数目及核型分析，确定风轮菜的染色体数目为2n=66，核型公式K=2n=2x=62m+4M.风轮菜染色体平均绝对长度为0.020 65 μm，属于小染色体，且各染色体的形态相似，数目较多，核型分析较困难.本研究在对风轮菜酶解的过程中将温度控制在56 ℃，酶解效果良好，每条染色体的形态清晰可见，减少了测量误差，保证了染色体形态结构信息的真实性.

风轮菜染色体臂比变化范围为1.000-1.389，不对称系数为53.71%，属于“1B”型，且根据其染色体相对长度系数得出，风轮菜的核型对称程度较高.文献资料表明，染色体对称的植物属于相对原始的类型，不对称者属于相对进化的类型，因此推测风轮菜的进化程度低，属于比较原始的类型.在植物进化过程中，其染色体的数目形态等特征相对稳定.同样，在不同植物的科与科间、亚科与亚科间、属与属间、种与种间，以及同种的不同居群中其染色体的大小、形态和结构也具有多样性.因此，核型分析可为研究生物的系统发育和近缘关系提供依据.与单纯的形态分类相比，染色体数据更可以解决常规形态分类难以解决的问题［15］.