黄孢原毛平革菌产絮凝剂营养条件优化

王小洁， 杨 锐， 兰 琪， 陈 刘， 刘 洁， 陈中维， 李宁杰*

1. 桂林理工大学， 广西环境污染控制理论与技术重点实验室， 广西 桂林 541004；2. 桂林理工大学， 岩溶地区水污染控制与用水安全保障协同创新中心， 广西 桂林 541004

微生物絮凝剂(Microbial flocculants，MBF)是一类从微生物体或其代谢产物中提取获得的一种具有絮凝活性的天然有机高分子物质，其有效成分可为多糖、蛋白质、脂质或有絮凝能力的菌体[1-8]。微生物絮凝剂与传统化学絮凝剂相比，具有生物可降解性、无毒性、无二次污染等优点[9-11]。近年来，研究生物絮凝剂替代有机合成高分子絮凝剂成为人们关注的热点[12]，但目前更多研究关注的是细菌中具有产絮凝剂能力的菌株的筛选[13]，真菌产絮菌的相关研究较少。有课题组前期研究发现白腐真菌的模式菌种黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)产生的胞外多糖具有絮凝能力，且用量很小[14]，说明该微生物絮凝剂具有进一步开发的意义，然而目前该微生物絮凝剂的产量较少，仍缺少对其产絮凝条件的优化研究。已有研究表明菌种的营养条件如碳源、氮源、碳氮比和接种量等会对絮凝剂的产量和絮凝效率产生很大影响。马龙等[15]通过研究一株微生物絮凝剂产生菌株W5的絮凝特性，发现以葡萄糖为碳源，酵母粉为氮源时其生物量及絮凝效率比其他的碳源和氮源的效果更好。钱宝钢等[16]研究了枯草芽孢杆菌产絮凝剂的最佳发酵条件，通过研究可知以硫酸铵和尿素为复合氮源时对高岭土的絮凝效率可达到98.2%，以蔗糖为碳源时其絮凝效率可达98.5%。徐长绘等[17]从土壤和污泥中筛选出絮凝性能高效且稳定的H14菌株，通过对营养条件等的探索使其产絮凝剂的性能得到优化，研究结果表明以葡萄糖和蛋白胨为最佳碳源和最佳氮源，当接种量为9%时絮凝剂产量最大，并且利用正交实验得出H14菌株在最佳的培养条件下，其絮凝剂的絮凝效率可达到91.0%。因此，探究Phanerochaetechrysosporium产絮凝剂的最佳培养条件从而提高絮凝剂的产量并确保絮凝活性，这对推进Phanerochaetechrysosporium产絮凝剂的实际应用有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

超细高岭土(≤2.5 μm)，葡萄糖、乳糖等，尿素、酵母膏等，氯化钙、硫酸镁等，均为分析纯。

YXQ-LS-70A立式压力蒸汽灭菌锅、ZHJH-C1112C超净台、TS-2102恒温振荡培养箱、ZR4-6六联搅拌机、UV-5800PC紫外-可见光分光光度计，FD-1A-50真空冷冻干燥机等。

1.2 菌种培养

实验菌种购买自中国典型培养物保藏中心的PhanerochaetechrysosporiumBKMF-1767 (CCTCC AF96007)，其产絮培养采用微量元素培养基(g/L)：KH2PO42.000，CaCl20.100，MgSO40.500，FeSO4·7H2O 0.115，MnSO4·H2O 0.112，ZnSO4·7H2O 0.089，CuSO4·5H2O 0.050，维生素B10.001，酒石酸铵0.206，葡萄糖10.000。将以上药品溶解于20 mmol/L的酒石酸-酒石酸钠缓冲液。

高压灭菌后培养基接种孢子浓度为106个/mL的孢子悬液，并置于30 ℃，180 r/min培养7 d。

1.3 培养基组分优化

碳源优化：葡萄糖分别替换为葡萄糖、葡萄糖和蔗糖1∶1、蔗糖、乳糖、甘油、可溶性淀粉，接种量为1%；氮源优化：酒石酸铵分别替换为NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4NO3、尿素、酵母膏，接种量为1%；碳氮比优化：使碳源(葡萄糖)固定不变，改变酒石酸铵的量使碳氮比变为4、8、16、32、50、60、70、80、90、100、110，接种量为1%；接种量优化：接种量选择0.125%、0.25%、0.5%、0.75%、1%和1.5%的孢子悬液，以葡萄糖为碳源，以酒石酸铵为氮源。

1.4 絮凝剂提取及絮凝实验

絮凝剂的提取方法[14]：高速离心分离得到7 d的培养液，经3 500 Da透析5 d，透析后的溶液经10 000 r/min离心20 min，所得上清液即为提取的絮凝剂。

絮凝剂浓度测定方法：前期实验表明Phanerochaetechrysosporium产生的絮凝剂有效成分是多糖，且多糖是Phanerochaetechrysosporium产生的胞外聚合物中的绝对主要成分[14]。因此本实验中絮凝剂的浓度就用多糖浓度表示，多糖浓度使用蒽酮-硫酸比色法测定。从培养液中分离得到的菌体，经冷冻干燥机冻干之后称量剩余菌球的干重测定生物量。

絮凝实验在六联搅拌器上进行，取200 mL的3 g/L的高岭土溶液，加入1 mg/L的絮凝剂，经400 r/min搅拌1 min，40 r/min搅拌3 min，再静置10 min，取上清液在550 nm波长下测定吸光度A1，以不加絮凝剂为对照组测定吸光度A0，絮凝效率=(A1-A0)/A0。每组设3组平行。

2 结果与分析

在不同培养基或不同接种量下，微生物生长情况不一样，用菌球干重和产生的多糖量来表示其生长情况。一般认为，菌球量和产生多糖量越多，说明该培养条件越适合真菌生长。而不同条件下Phanerochaetechrysosporium产絮凝剂的絮凝效率也存在差别。

2.1 碳源的影响

从图1a可知，葡萄糖和淀粉作为碳源时，Phanerochaetechrysosporium的生物量(菌球干重)及代谢多糖量较高，其中可溶性淀粉为碳源时的菌球干重为4.35 g/L，代谢多糖为256.80 mg/L，葡萄糖作为碳源时的菌球干重为2.84 g/L，代谢多糖为281.31 mg/L，淀粉结构为葡萄糖分子聚合而成，则可认为，葡萄糖的结构易被Phanerochaetechrysosporium吸收利用；葡萄糖与蔗糖1∶1作为碳源产生的菌球干重为3.17 g/L，比单独的葡萄糖要高，但结合蔗糖单独作为碳源时的产量可推测导致真菌生物量升高的原因是葡萄糖；乳糖和甘油作为碳源时真菌生长量很低，乳糖组几乎不生长，甘油组虽产生少量较小的菌球，但基本不代谢产生胞外多糖。从结果来看，双糖和甘油难以被真菌吸收利用，葡萄糖或以葡萄糖为单体的淀粉易被真菌生长利用。

由图1b可知，以葡萄糖和混合碳源培养产生的絮凝剂絮凝效果都较好，絮凝效率分别为65%和60%；但单独用蔗糖培养的则絮凝活性很低，絮凝效率只有10%，用淀粉为碳源产生的絮凝剂絮凝效率为43%，其絮凝效率低于葡萄糖，这一结果与生物量和多糖产量时的实验结果不同，表明不是所有的微生物多糖都具有絮凝性能，进行营养条件优化的最终目的是寻找最佳的产絮凝剂因素，因此综合考虑，以葡萄糖作为Phanerochaetechrysosporium产絮凝剂的最佳碳源。

图1 不同碳源对真菌生长、多糖产量及絮凝效率的影响

2.2 氮源的影响

由图2a可知，与其他的氮源相比以尿素为氮源时菌球生长量(菌球干重)最多，达到5.08 g/L，以硝酸铵为氮源时产多糖最多，达到163.61 mg/L；酵母膏为氮源时真菌的生长代谢不太稳定，而其它几种铵盐作为氮源都未获得较多的多糖。优化培养是以获得更多高絮凝活性的絮凝剂为目的，因此，以硝酸铵为氮源比较适合。由实验可知氮源对多糖产量的影响为：硝酸铵>酵母膏>尿素>氯化铵>酒石酸铵>硫酸铵，此前LI等[18]认为目前还没有能够有效利用无机氮的微生物产生絮凝剂，而本实验证明了Phanerochaetechrysosporium可以有效利用硝酸铵等无机氮源生产絮凝剂。

由图2b可知，絮凝效果最好的是以硝酸铵为氮源的培养基产生的絮凝剂，其絮凝效率为82.5%；酵母膏为氮源时产生的絮凝剂虽然絮凝效率为81.8%，仅低于硝酸铵组，但其产絮凝剂的量较硝酸铵作为氮源时产絮凝剂的量少33.5%；以尿素为氮源生产的絮凝剂絮凝效率为62.8%，虽然效果不如硝酸铵，但其成本较低；其它几种铵盐作为氮源生产的絮凝剂都未获得太理想的实验结果。因此，结合生物量、多糖产生量以及絮凝效率可确定最佳的氮源为硝酸铵。

图2 不同氮源对真菌生长、多糖产量及絮凝效率的影响

2.3 碳氮比的影响

图3a为在固定葡萄糖浓度为10 g/L时，不同碳氮比条件下真菌的生长情况，从图上可以看出，碳氮比从4～60时真菌生物量呈现上升的趋势，而继续升高碳氮比，则生物量开始降低。碳氮比低于50时，絮凝剂的产生受到明显抑制，从总体来看，高碳氮比相对于低碳氮比产生多糖量要更多。在一定碳元素下，氮元素过高不利于絮凝剂的产生，而氮元素过低也会限制真菌代谢多糖。对于Phanerochaetechrysosporium而言，碳氮比为60～100时，产生的多糖量为440～540 mg/L，最有利于其产生絮凝剂。

由图3b可以看出，低碳氮比时产生的絮凝剂絮凝活性较低，当碳氮比在高于50时，絮凝效率较高，其中以碳氮比为90时产生的絮凝剂活性最高，其絮凝效率为80.5%，因此可将碳氮比为90作为Phanerochaetechrysosporium产絮凝剂的最佳碳氮比。

图3 不同碳氮比对真菌生长、多糖产量及絮凝效率的影响

2.4 接种量的影响

从图4a可以看出，接种0.25%～1%孢子悬液时，真菌生长量影响不大，都在2.8 g/L左右，但是接种0.125%孢子悬液时，生物量明显减少到2.4 g/L，说明需要接种一定的孢子浓度才能使得真菌快速地生长。接种1.5%孢子悬液时，真菌生物量开始下降为2.7 g/L，这表明过大或过小的接种量都会对微生物絮凝剂的生成造成不利影响，即接种量有一定的范围，超过这个范围，便不利于真菌生长。有研究表明：过小的接种量会延长停滞期，而过大的接种量会使真菌的生态位受到极大的干扰，阻碍微生物絮凝剂的合成[12]。多糖的产生量与真菌的生长量的趋势相同，在接种量为1%时达到最大(155.57 mg/L)。

图4 不同接种量对真菌生长、多糖产量及絮凝效率的影响

由图4b可以看出，不同接种量培养下产生的絮凝剂絮凝活性没有太大差异，可见接种量对Phanerochaetechrysosporium产絮凝剂没有太大影响，其中接种1%吸光度为1.000的孢子悬液的絮凝效率最高，其絮凝效率为87.14%，相对于其他的接种量来说，可以将1%作为最佳的接种量。

3 结论

碳源、氮源以及碳氮比对Phanerochaetechrysosporium的生长和产生絮凝剂的活性影响较大。通过探究可知淀粉作为碳源时有利于Phanerochaetechrysosporium的生长，但其产生的絮凝剂的絮凝效率仅为43%，而以葡萄糖作为碳源时所产生的絮凝剂的絮凝效率为65%，且葡萄糖容易被Phanerochaetechrysosporium吸收利用，因此以葡萄糖作为最佳培养碳源。尿素为氮源时真菌生物量最高，但产生的絮凝剂的絮凝效率仅为62.8%，而硝酸铵作为氮源产生的絮凝剂的活性最高，其絮凝效率可达82.5%。碳氮比低于50时，絮凝剂的产生受到明显抑制，絮凝剂的产量与活性都较低，而碳氮比过高也会抑制絮凝剂的产生，最佳产絮凝剂碳氮比为90。接种量对真菌生长和絮凝剂的絮凝活性影响较小，由研究结果可知，最佳接种量为1%，其产生的絮凝剂的絮凝效率为87.14%。综上所述，最佳营养条件是以葡萄糖为碳源，硝酸铵为氮源，碳氮比为90，接种量为1%。通过对Phanerochaetechrysosporium产絮凝剂的培养条件进行优化，可以使Phanerochaetechrysosporium在微生物絮凝剂方面得到较大利用。