胶红酵母CYJ03的体外体内抗氧化活性研究

汤 伟， 李佳欣， 王 悦， 张 军, 3， 何增国

1.中国海洋大学医药学院，青岛 266000；2.青岛海洋生物医药研究院海洋微生物工程研发中心，青岛 266000；3.青岛百奥安泰生物科技有限公司，青岛 266000

红酵母是一类抗逆性强，广泛存在于自然界中的腐生菌，其最显著的特征之一是能够合成天然的类胡萝卜素。与化学合成相比，红酵母生物合成的类胡萝卜素是天然的、有机的；与藻类和丝状真菌发酵相比，利用红酵母发酵生产类胡萝卜素生产周期短、环境友好、易于通过发酵工程放大，具有极高的应用价值和开发前景[1]。另外红酵母蛋白、脂肪含量高，可以作为优质的单细胞蛋白，作为极具价值的饲料添加剂应用于畜禽、水产养殖产业。

红酵母能够提高动物免疫力，增强抗应激能力，红酵母作为天然的微生态抗氧化剂，在动物养殖中的良好应用已初见端倪。在宝石鲈基础饲料中添加胶红酵母可以促进个体生长，提高鱼体的抗氧化能力、减少自由基的损害等[2]。饲料中添加Rhodotorulasp. H26可促进幼参生长、增强消化酶活性、增加营养价值，并刺激幼参先天免疫系统[3]。在基础饵料中添加胶红酵母可以显著提高刺参抗氧化酶的活性，这可能与胶红酵母中含有丰富的抗氧化和免疫增强组分有关[4]。将贝莱斯芽孢杆菌和胶红酵母的复合菌剂应用于大西洋鲑幼鱼养殖，能显著提高鲑鱼血清中抗氧化酶类、谷胱甘肽、总抗氧化能力和免疫球蛋白M的含量，同时复合菌的使用还能有效调控大西洋鲑鱼的免疫应答[5]。

尽管许多红酵母菌株在动物实验中的功效已被证实，但目前仍然只有红法夫酵母(Phaffiarhodozyma)被列入《饲料添加剂品种目录(2013)》中，因此开发我国具有自主知识产权的新红酵母菌种，对动物养殖及微生物产品和产业化升级起到积极的助力作用。课题组前期从黄海北部海域分离得到一株胶红酵母CYJ03，已完成该菌的全基因组测序[6]，同时该菌株表现出极高的抗逆性，如耐受高浓度NaCl、葡萄糖、耐低温等特性(数据未公开)，以及本实验所提到的过氧化氢耐受性。为进一步挖掘菌株的应用潜力，我们系统地评价了CYJ03体外及体内抗氧化活性，这些数据可以为将来对菌株的进一步开发利用提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株和培养基

胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)CYJ03由本课题组分离自海洋，并保存于中国微生物菌种保藏管理委员会，菌种保藏号为CGMCC No.16302。

YPD液体培养基： 葡萄糖20 g/L， 蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，蒸馏水定容至1 L，pH自然，115 ℃灭菌20 min。

1.2 主要试剂和仪器

三氯乙酸、过氧化氢、铁氰化钾、水杨酸、邻菲罗啉、二甲基亚砜等化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司；二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)购自源叶生物科技有限公司；BCA法微量蛋白检测试剂盒、总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

酶标仪，美国BioTek Instruments；单排四层养殖单元，上海海圣生物实验设备有限公司；全自动样品快速研磨仪-24 L，上海净信；高速冷冻离心机，Hitachi CR21N。

1.3 鱼苗及饲料

鱼苗：红罗非鱼，购买自广州粤强丰水产养殖场。

基础饲料主要原料组成：鱼粉、豆粕、小麦粉、酵母水解物、甘油、豆油、磷酸氢二钙、维生素及矿物质预混合添加剂等。饲料产品成分见表1。

表1 饲料产品成分

1.4 体外抗氧化作用的研究

1.4.1样品的制备

将CYJ03在YPD液体培养基中28 ℃、 180 r/min摇床培养48 h， 4 000 r/min离心15 min，得到发酵上清液；离心后的菌体沉淀用无菌去离子水洗涤3次，调整细胞浓度为1.0×108CFU/mL，获得完整细胞；将菌体烘干，用 DMSO 进行色素提取，最终得到色素提取物。

1.4.2体外抗氧化指标的测定

过氧化氢耐受性试验参照TANG W[7]的方法；还原力的测定参照苟体忠[8]的方法；DPPH·清除力测定参照LIN MY[9]的方法；·OH清除力测定参照GUTTERIDE CJM等[10]的方法；螯合亚铁离子能力的测定参照张乔丽[11]的方法进行。

1.5 体内抗氧化作用的研究

1.5.1罗非鱼养殖及实验分组

红罗非鱼先空腹放养1 d，基础饲料饲喂适应环境7 d，随后选择体质健康、规格大小一致、平均体重为5 g左右的红罗非鱼作为实验对象，随即将其分为4组，分别为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。每组三个重复，每缸10尾。对照组饲喂基础饲料，低、中、高剂量组在基础饲料中分别拌入0.5%、1%和2%的胶红酵母CYJ03冻干粉(菌活为2.66×1010CFU/g)。投喂时间为8:30和16:30，每日投喂量以鱼体重的2%～5%为准，每日2次。水温控制在25 ℃～30 ℃左右，溶氧5 g/L以上，流水速度4 mL/s，共持续60 d。

1.5.2血清和肝脏样品的制备

饲养周期结束后禁食1 d。将鱼放在冰上冷却数分钟，使其麻痹，统计每缸鱼的体重、数量。断尾取血，血液静置0.5 h，以4 000 r/min离心15 min，吸取上清液置于-80 ℃冻存备用。摘取肝脏，漂洗、除去杂质、吸干水分、称重，按1∶9加入缓冲液研磨，4 ℃、4 000 r/min 离心10 min，收集上清液置于-80 ℃冻存备用。

1.5.3罗非鱼生长性能的测定

饲养周期结束后计算罗非鱼增重率(WG,%)=100×(Wt-W0)/W0；特定生长率 (SGR，%/d)=100×(lnWt-lnW0)/t；饲料系数 (FCR)=FI/(Wt-W0)；肝体比 (HSI)=Wh/W。其中，W0为实验开始时罗非鱼平均体重(g)、Wt为实验结束时罗非鱼平均体重(g)、t为养殖时间(d) 、FI为实验过程中摄食的饲料重量(g)、Wh为所取肝脏的重量(g)；W为所取肝脏的罗非鱼体重(g)。

1.5.4体内抗氧化指标的测定

T-AOC、CAT、SOD、GSH-Px 活性及 BCA 蛋白含量的测定参照南京建成试剂盒说明书操作。

1.6 数据处理

数据采用SPSS 23(IBM公司，美国)进行单因素方差分析，利用邓肯多重检验分析样品间差异性，显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 胶红酵母CYJ03体外抗氧化活性

2.1.1过氧化氢耐受性

将胶红酵母CYJ03在含有不同浓度H2O2条件下培养48 h，测定菌体的存活率，结果表明，在含有1 mmol/L和3 mmol/L H2O2时能够促进菌体的生长。当H2O2浓度高于3 mmol/L时，菌体的相对存活率降低，菌体生长受到抑制；当H2O2浓度为11 mmol/L时仍有26.12%的存活率，13 mmol/L时存活率降至2.58%(图1)，CYJ03对过氧化氢极强的耐受性在同类报道中极为少见。

图1 胶红酵母CYJ03在不同H2O2浓度下的存活特性

2.1.2CYJ03的还原力

样品的还原力与抗氧化能力存在着一定的相关性，还原电位越高给出电子的能力就越强，其抗氧化活性可能就越强。本实验利用铁氰化钾法研究了CYJ03三个组分的还原力(图2-a)，其中以发酵上清液的还原力最高，色素提取物次之，完整细胞相对最弱，分别为0.26±0.02、0.22±0.01、0.13±0.01。

2.1.3CYJ03的DPPH·清除能力

DPPH·是一种人工合成的具有单电子的有机自由基，可以与具有还原性的自由基进行单电子配对，溶液的褪色程度与单电子配对数呈现一定关系，因而DPPH·清除能力的测定被广泛应用于抗氧化剂的抗氧化能力评价。CYJ03的三个组分均有一定的DPPH·清除作用，以发酵上清液的清除力最强可达92.92%，完整细胞和色素提取物的分别为56.79%和9.29%(图2-b)。

2.1.4CYJ03的·OH清除能力

·OH是生物分子与过渡金属离子参与芬顿反应造成的氧化损伤所产生的，抗氧化剂能够螯合过渡金属离子从而抑制·OH的生成，因此可以通过对·OH的清除率来反映抗氧化能力强弱。胶红酵母CYJ03各组分都具有一定的·OH清除能力，清除力在30%～45%之间，·OH清除力大小依次为色素提取物>完整细胞>发酵上清液(图2-c)。

2.1.5CYJ03对Fe2+的螯合能力

金属离子的螯合能力被认为是研究抗氧化活性的指标之一，由于抗氧化物质能够降低脂质过氧化反应中过渡金属离子的浓度。在过渡金属离子中，由于具有较高的活性，因此 Fe2+被认为是最重要的脂质氧化助氧化剂。因此本试验对CYJ03的Fe2+螯合能力进行了研究。发酵上清液的 Fe2+的螯合率最大，达到 83.81%，显著高于完整细胞和色素提取物对Fe2+的螯合率(P<0.05)(图2-d)。

(a)：还原力；(b)：DPPH·的清除率；(c)：·OH的清除率；(d)：Fe2+螯合率

除却还原力，从各组分体外抗氧化数据中我们还可以发现，发酵上清液和完整细胞对于DPPH·、·OH的清除力以及Fe2+的螯合能力表现出相同的规律，即DPPH·的清除率>Fe2+螯合率>·OH的清除率，而色素提取物则恰恰表现出相反的结果，即·OH的清除率>Fe2+螯合率>DPPH·的清除率。

2.2 胶红酵母CYJ03体内抗氧化活性

2.2.1CYJ03对罗非鱼生长性能的影响

如表2所示，低、中、高3个实验组在实验结束后罗非鱼的均重、增重率、特定生长率和肝体比均显著高于对照组，其中以中剂量组最显著(P<0.05)；三个实验组的饵料系数均显著低于对照组(P<0.05)，其中以中剂量组的饲料系数最低，达到1.67±0.17。从以上结果可以看出，饲料中添加1%的CYJ03可以有效提高罗非鱼的体重、增重率、特定生长率及肝体比，降低其饵料系数。

表2 CYJ03不同添加量对罗非鱼生长性能的影响

2.2.2CYJ03对罗非鱼血清和肝脏组织中总抗氧化能力及抗氧化酶活性的影响

T-AOC反映了非酶作用的抗氧化防御能力，与对照组相比，中剂量组血清和肝脏组织中的T-AOC均显著高于对照组(P<0.05)，见图3-a。同时，在罗非鱼血清和肝脏中的三种抗氧化酶(CAT、SOD和GSH-Px)活性也被检测，添加胶红酵母CYJ03能够不同程度的提高罗非鱼血清和肝脏中的抗氧化酶活性，且中剂量组最显著；随着添加量的增高，其抗氧化水平并非成上升趋势，当添加量高于1%时，T-AOC及抗氧化酶活性都有所降低，这与生长性能的变化趋势相一致(图3-b、图3-c和图3-d)。

(a)：血清和肝脏中T-AOC活力；(b)：血清和肝脏中CAT活性；(c)：血清和肝脏中SOD活性；(d)：血清和肝脏中GSH-Px活性

3 讨论

对过氧化氢的耐受性是衡量细胞抗氧化活性的重要指标。酵母细胞受H2O2刺激后，胞内自由基含量上升，攻击多种细胞组分导致细胞失活。高抗氧化活性酵母通过自身代谢调整胞内氧化还原状态，提高抗氧化性能，降低自由基积累量，避免细胞凋亡。李磊等[12]用不同浓度的H2O2处理啤酒酵母(Saccharomycespastorianus) Pilsner 1 h，当H2O2浓度达10 mmol/L、12 mmol/L时，致死率分别为98.90%和99.35%。通过本研究发现，胶红酵母CYJ03具有极强的过氧化氢耐受性，在H2O2浓度为11 mmol/L时仍有26.12%的存活率，13 mmol/L时尚有2.58%存活率。

前期我们通过对胶红酵母 CYJ03全基因组测序分析，发现菌株可代谢产生多种类胡萝卜素，如八氢番茄红素、链孢红素、番茄红素、γ-胡萝卜素、β-胡萝卜素和红酵母烯等[6]。众所周知，类胡萝卜素具有优良的抗氧化活性，能有效清除自由基。李慧翔[20]从法夫酵母中纯化得到的虾青素对DPPH·、·OH、ABTS+3种自由基都表现出极好的清除能力，EC50值分别为22.40 μg/mL、12.62 μg/mL、5.75 μg/mL。本课题组也研究了来源不同的6株红酵母的色素提取物均有不同程度的还原力、DPPH·清除力、·OH清除力和Fe2+螯合力[21]。YOO AY等[22]利用甲醇法从胶红酵母中提取的类胡萝卜素，发现其对不同的自由基清除能力存在差异，这可能是由于类胡萝卜素中所含的羧基、胺或磺酰的碳水化合物会靶向不同的自由基[23]。

此外，CYJ03完整细胞也具有较高的抗氧化活性，一方面可能是由于细胞表面的活性物质对自由基的清除作用，从而阻止其进入到细胞内部。如酵母细胞壁多糖的主要活性成分是β-葡聚糖和甘露聚糖，利用其结构与Fe2+螯合，抑制·OH的产生以及防止脂质过氧化连锁反应等，提高抗氧化能力[24]。另一方面酵母胞内的抗氧化酶类如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱苷肽还原酶及硫氧还蛋白还原酶等，和非酶物质如谷胱甘肽、硫氧还蛋白、谷氧还蛋白、金属硫蛋白、维生素C、维生素E等对进入到细胞内部的自由基进行清除，从而起到抗氧化作用，阻止对酵母细胞进一步的氧化损伤[25]。综上，胶红酵母CYJ03无论是发酵上清液，还是细胞内类胡萝卜素，又或者是细胞本身，都具有良好的体外抗氧化活性，这充分显示出CYJ03全细胞发酵物本身具有开发成抗氧化产品的潜力。

与此同时，我们在饲料中添加CYJ03饲喂罗非鱼，研究菌株在水产养殖动物体内的抗氧化作用。目前应用红酵母改善水生生物的生长状况、抗氧化活性及免疫活性的相关研究已有报道。红酵母可以改善幼参及尼罗罗非鱼的生长情况、消化酶活性及免疫活性[26,27]。WANG JH等[28]在刺身幼体饲料中添加105CFU/g、106CFU/g、107CFU/g的R.benthicaD30，结果发现 D30 可显著提高海参的生长速度 (P<0.05) 、降低海参的累积死亡率、提高免疫力。YANG SP等[29]为凡纳滨对虾饲喂三种日粮，包括对照日粮，添加1%干红冬孢酵母的日粮和含108CFU/g活红冬孢酵母的日粮，结果发现添加活酵母的试验组其 T-AOC、CAT、SOD、GSH-PX 活性均高于添加干酵母的试验组，说明活菌中可能存在某些物质，可以增强抗氧化酶活性。董兰芳等[30]研究了酵母水解物对吉富罗非鱼生长、免疫力、抗氧化性及抗无乳链球菌感染的影响，结果发现吉富罗非鱼的免疫酶和抗氧化酶(CAT和SOD)活性均随饲料中酵母水解物添加量的增加而显著提高，在添加量为1.5%时达到最大值，而后出现一定的降低，过量添加酵母水解物并不能强化已处于正常状态的免疫系统。这与本研究的结果相一致。本研究中胶红酵母CYJ03能显著提高罗非鱼的增重率、特定生长率和肝体比，显著降低饲料系数；同时能够显著提高罗非鱼血清和肝脏的总抗氧化能力以及抗氧化酶的活性，且以中剂量组最为显著。

4 结论

海洋源胶红酵母CYJ03具有极强的过氧化氢耐受性，并且其发酵上清液、完整细胞和色素提取物均具有一定程度的还原力、DPPH·清除力、·OH清除力和Fe2+螯合能力。在日粮中添加CYJ03能够提高罗非鱼的生长性能，降低饲料系数，并能提高血清和肝脏中T-AOC、SOD、CAT和 GSH-Px的活性，添加量为1%时效果最显著。海洋源胶红酵母CYJ03具有开发成产品的良好潜力。