分散固相萃取剂-液相色谱串联质谱法测定鸡肉和鸡蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺残留

杨诗珍

上海天祥质量技术服务有限公司食品部, 上海 200233

氟苯尼考(Florfenicol)，又称氟甲砜霉素，属于酰胺醇类抗生素，对革兰氏阴阳性及支原体细菌均有效。安全性及药性比氯霉素及甲砜霉素效果好，由于氯霉素禁用于畜禽动物，因此其在中国和国外养殖业迅速大规模使用。随着研发深入，发现氟苯尼考对胚胎产生毒性，畜禽在用药后，出现厌食、腹泻等身体不健康反应；如养殖者不规范使用氟苯尼考，未严格遵循休药期，会导致畜禽食品中残留过高，直接危害到人类健康[1]。氟苯尼考在动物体内的主要代谢标志物是氟苯尼考胺，欧盟在2010年之前，已规定动物源性食品中氟苯尼考最大残留限量，用氟苯尼考及氟苯尼考胺作为检出物。我国于2019年在GB 31650—2019兽残残留限量标准中规定了氟苯尼考的最大残留限量，其残留标志物用氟苯尼考与氟苯尼考胺之和表示。其中家禽的最大残留量为100 μg/kg ～2 500 μg/kg,产蛋期禁用。

关于动物性食品中氟苯尼考残留的检测标准比较多，也比较成熟[2]；但是关于氟苯尼考及氟苯尼考胺同时测定，只有一个行业标准[3]；文献中有测试鱼肉中氟苯尼考及氟苯尼考胺残留的HPLC-MS/MS方法[4]，还有文献关于鸡蛋中的残留用液相色谱法测试[5]。动物组织特别是鸡肉和鸡蛋为高蛋白、高油脂动物组织，很难通过较有效前处理手段将上机溶液净化干净；在仪器端，液相色谱选择性较差，也难将目标物和基质中杂质有效分离。针对复杂基质样品分析，液相色谱串联质谱就有比较明显的优势；鸡肉和鸡蛋都是人民大众主要的食物来源之一，因此，研究建立鸡肉和鸡蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺测定的液相色谱串联质谱法具有重要意义。本方法建立同时测定鸡肉和鸡蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺的液相色谱串联质谱方法，乙腈提取，C18分散固相萃取剂净化，同位素内标法定量。

1 仪器和试剂

1.1 仪器

HPLC-MS/MS：Waters TQ-S；色谱柱(Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm))；分析天平(Melter/Ms204S)；搅拌机(飞利浦)；冷冻离心机(Eppendorf/5810R)；超声提取仪(上海科导)；氮吹仪(O-EVAP TM 112，美国)；涡旋混合器(KA)；高速分散均质机(上海标本模型厂)；固相萃取装置(Supelco)。

1.2 试剂及耗材

超纯水(Millipore超纯水系统)；乙腈(HPLC级，Aocs)；甲醇(HPLC级，Aocs)；正己烷(HPLC级，Aocs)；氨水(GR)；氯化钠(AR，上海国药)；无水硫酸钠，马弗炉 550 ℃灼烧 2 h后，冷却后密封保存使用；C18分散固相萃取剂。

1.3 标准物质

氟苯尼考(Florfenicol)，CAS：73231-34-2，分子式：C12H14Cl2FNO4S，分子量：358.2。

氯霉素-D5(ChloraMphenicol-D5)，CAS：202480-68-0，分子式：C11H7Cl2D5N2O5，分子量：328.1。

氟苯尼考胺(Florfenicol amine)，CAS：108656-33-3，分子式：C10H14FNO3S，分子量：375.2。

氟苯尼考胺-D3(Florfenicol-d3 Amine)，CAS：76639-93-5，分子式：C10H11D3FNO3S，分子量：250.3。以上标准品均购自Dr. E.公司。

1.4 试剂的配置

10%乙腈水溶液：量取 10 mL 乙腈，用水稀释至 100 mL。

0.01%氨水溶液：量取 100 μL 氨水加入 1 L 超纯水中，充分混匀。

1.5 标准溶液的配置

1.5.1储备液(1 000 mg/L)：

分别准确称取氟苯尼考、氟苯尼考胺、氟苯尼考胺-D3 和氯霉素-D5 标准品 10.0 mg(按纯度示值折算)，用甲醇溶解并定容至 10 mL，标准储备溶液质量浓度均为 1 000 μg/mL。-20 ℃ 以下避光贮存，保存期为12个月。

1.5.2中间液(氟苯尼考10 μg/mL，氟苯尼考胺 100 μg/mL)：

分别准确量取 100 μL 氟苯尼考和 1 000 μL氟苯尼考胺储备液，用甲醇定容至10 mL，标准中间液浓度分别为氟苯尼考10 μg/mL，氟苯尼考胺 100 μg/mL，-20 ℃ 以下避光贮存，保存期为 6 个月。

1.5.3内标混合中间液(10 μg/mL)：

分别准确量取 100 μL 氟苯尼考胺-D3 和氯霉素-D5 标准标准储备液，用甲醇定容至10 mL，内标标准中间液质量浓度为 10 μg/mL，-20 ℃以下避光贮存，保存期为 6 个月。

1.5.4标准混合使用液(氟苯尼考 10 ng/mL，氟苯尼考胺100 ng/mL)：

准确吸取标准混合中间液 100 μL，用 10%乙腈-水溶液定容至 100 mL，标准混合使用液浓度为氟苯尼考 10 ng/mL，氟苯尼考胺100 ng/mL，4 ℃贮存，保存期为一周。

1.5.5内标标准混合使用液(100 ng/mL)：

准确吸取内标标准混合中间液 100 μL，用 10%乙腈-水溶液定容至 10 mL，内标标准混合使用液浓度为 100 ng/mL，4 ℃贮存，保存期为一周。

1.5.6标准工作液的配制，见表1：

表1 标准工作液的配制

1.6 试样的前处理

1.6.1提取

称取经过均质的试样 2.0 g(精确到 0.01 g)到50 mL聚丙烯离心管中，准确加入50 μL内标标准使用液，加1 mL水漩涡混匀，再加10 mL乙腈， 漩涡混合30 s，超声提取10 min。10 000 r/min 离心 10 min(温度低于5 ℃)。 上清液待转移。

1.6.2净化

再取一个15 mL 离心管，加入 250 mg,C18分散固相萃取剂和 2 g 无水硫酸钠，移入1.6.1上清液 7 mL，振摇1 min，以12 000 r/min 的转速离心 5 min，取上清液 5 mL 转移至另一离心管中，在低流速氮气下吹干，加入 0.5 mL 10%乙腈水溶液溶解残渣，涡旋混合 1 min，转移至1.5 mL 离心管中， 加入 0.5 mL 正己烷，充分震荡1 min，以12 000 r/min的转速 离心 5 min，弃去正己烷层。 吸取下层用于HPLC-MS-MS 测定。

1.7 HPLC-MS-MS分析条件

1.7.1HPLC条件

(a) 色谱柱： Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)； (b) 流动相：A相为0.01%氨水溶液，B相为乙腈； (c) 流速：0.35 mL/min； (d) 进样量：5 μL。

流动相梯度见表2。

表2 流动相

1.7.2质谱条件

(a) 离子源：电喷雾ESI离子源； (b) 扫描方式：正离子和负模式扫描； (c) 检测方式： SRM； (d) 电喷雾电压：3 500 v； (e) 鞘气：高纯氮气，5 psi； (f) 辅助气：高纯氩气，5 psi； (g) 监测离子对情况。

质谱采集参数见表3。

表3 质谱采集参数

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂及净化方法的选择

氟苯尼考极性极弱，不易溶于水，在有机溶剂中溶解性较强；氟苯尼考胺具有碱性，极易溶于水，水溶解后，可再溶于有机溶剂；在已有的国标[2,3]中，使用乙酸乙酯提取氟苯尼考；用碱性乙酸乙酯提取氟苯尼考胺。考虑到鸡蛋的蛋白质含量比较高，乙腈是一种比较好的沉淀蛋白的有机溶剂，并结合国标中提取剂，本方法比较了乙酸乙酯、碱性乙酸乙酯及乙腈三种不同溶剂提取目标物；实验发现，鸡蛋中加入乙腈提取，起到沉淀蛋白质的作用，提高了净化效果，减小基质干扰，确保测试结果更准确，回收率比较见表4。分析原因是鸡肉和鸡蛋中水分含量高，水和乙腈为互溶溶剂，可以保证了氟苯尼考胺的提取效率。本方法净化方法区别于传统兽残检测方法，现有的国标或文献中，兽残检测均采样SPE柱净化方式，但随着农残Quechers方法的成熟应用，大大节省净化过程时间，同样可以得到很好准确度；所以，本方法尝试了C18分散固相萃取剂净化，实验发现，分散固相萃取剂净化效果好，基质干扰小，前处理操作过程从4 h降至2 h，回收率和重现性同样满足GB/T 27404—2005的要求。

表4 不同溶剂提取，鸡蛋和鸡肉中氟苯尼考胺、氟苯尼考回收率比较

2.2 液相条件及质谱条件的确定

2.2.1色谱条件的优化

氟苯尼考为弱极性物质，在C18柱上有较强的保留，色谱条件相对容易选择；而氟苯尼考胺为碱性化合物，是极性比较强的化合物，在普通C18柱上基本没有保留；对比不同品牌C18柱，基本是色谱柱死体积出峰，无保留，最终发现Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)对氟苯尼考胺有一定的保留，保留时间为2.26 min。选择纯水、乙腈作流动相时，发现氟苯尼考胺峰型不对称，有拖尾现象，后在水相加入氨水，调整流动相的pH值，消除了氟苯尼考胺拖尾现象，得到比较对称的峰型。为了更好地分离目标物和样品中的杂质，此方法最终选择0.01%氨水溶液和乙腈进行梯度分析，样品总的运行时间为8.5 min，让杂质能够完全流出，避免对下一针样品产生柱上污染。

2.2.2质谱条件的优化

HPLC-MS-MS采样的是电喷雾离子化(ESI)使化合物带电，氟苯尼考为酸性化合物，采样负模式电喷雾离子源；氟苯尼考胺含有氨基官能团，选择用正模式电喷雾离子源，进行离子扫描。表3为确认的质谱采集参数；图1为氟苯尼考胺、氟苯尼考及氟苯尼考胺-D3、氯霉素-D5的标准品多反应监测模式离子描谱图。

图1 氟苯尼考胺、氟苯尼考及氟苯尼考胺-D3、氯霉素-D5的标准品MRM模式离子描谱图

2.3 线性范围

由于HPLC-MS/MS受基质效应，影响结果准确定量，本文采样氯霉素-D5和氟苯尼考胺-D3分别作为氟苯尼考和氟苯尼考胺内标物，分别配制氟苯尼考和氟苯尼考胺曲线浓度点，为0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL，和 1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL，利用MRM离子扫描方式，用定量离子的峰面积对质量浓度进行线性回归计算，氟苯尼考线在0.1μg/mL ～2.0 μg/mL 范围，R2≥0.995，氟苯尼考胺线在1.0 μg/mL ～20.0 μg/mL范围，R2≥0.995，线性关系均良好(见图2)。

图2 氟苯尼考胺、氟苯尼考的工作曲线

2.4 定量限、方法回收率和精密度

分别取鸡肉、鸡蛋空白基质样品，进行添加回收率和精密度试验，添加水平：氟苯尼考胺为0.5μg/kg、2.5 μg/kg和5.0 μg/kg，氟苯尼考为0.0 μg/kg、0.25μg/kg和0.5 μg/kg，添加后混合静置，使标准溶液被样品充分吸收，每个浓度水平进行7次平行试验，确定该方法的定量限、回收率和精密度。得氟苯尼考和氟苯尼考胺检出限分别为0.05 μg/kg和 0.5 μg/kg；回收率在68.0%～90.8%之间，相对标准偏差在1.6%～4.6%之间。鸡肉和鸡蛋加标回收率和RSD见表5和表6，图3为鸡蛋空白样品加标的MRM模式离子描谱图。

图3 氟苯尼考胺、氟苯尼考及氟苯尼考胺-D3、氯霉素-D5鸡蛋空白加标多反应监测模式离子描谱图

表5 鸡蛋中氟苯尼考胺、氟苯尼考的标样添加量、加标回收率和相对标准偏差

表6 鸡肉中氟苯尼考胺、氟苯尼考的标样添加量、加标回收率和相对标准偏差

2.5 方法的应用

从市场分别采购鸡肉和鸡蛋样本，20个鸡肉样本中有5个样本氟苯尼考检出，检出含量在0.10 μg/kg～1.17 μg/kg之间，氟苯尼考胺均未检出，均符合GB 31650—2019 食品中兽药最大残留限量。20个鸡蛋样本中，有1个样本检出氟苯尼考，检出含量为0.08 μg/kg，不符合限量要求；鸡蛋中氟苯尼考胺均未检出。检测结果见表7。

表7 20个鸡肉和鸡蛋样本检出结果统计表

3 结论

本方法采用乙腈溶液为目标物提取剂，将C18分散固相萃取剂与LC/MS/MS技术相结合，建立了一种测定鸡蛋和鸡肉中氟苯尼考及氟苯尼考胺残留同时测定的方法。该方法操作简单有效，方法灵敏度满足残留限值要求，可适用于样品的高通量测试。