异甘草酸镁干预肝纤维化大鼠肝细胞体积与数量的体视学*

王川林 崔秋林 刘全明 杨正伟 梅小平 彭 彬

（川北医学院，1 附属医院感染科，2 临床医学系，3 形态定量研究室，4 电镜结构研究室，南充 637000）

肝纤维化是指各种损伤因子慢性刺激所导致肝组织内细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的异常沉积与过度增生的一种动态病理改变，肝星状细胞的活化被认为是ECM 的主要来源[1-3]。值得注意的是，除了ECM 的过度增生，肝纤维化的进程还伴随着肝细胞的变性、坏死和肝细胞结节状再生。肝细胞作为肝中最主要的细胞也参与了肝纤维化的发生和发展。当肝受到病毒感染、药物或化学药品损伤导致炎症或机械刺激损伤时，受损的肝细胞通过旁分泌释放炎性介质激活肝星状细胞，并分泌大量的ECM，形成肝纤维化[3-6]。但是迄今为止，肝纤维化所伴随的肝细胞病理改变定量数据尚未见报道，如肝细胞的总数量、总体积、肝细胞内脂滴的总体积、每个肝细胞的平均体积等。因此，本研究拟探讨四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）致肝纤维化大鼠肝细胞上述形态定量指标的变化。异甘草酸镁（magnesium isoglycyrrhizinate，MgIG）是第4 代甘草酸制剂，已被证明具有抗炎、抗氧化、稳定肝细胞膜以及保护肝细胞功能的作用[7-8]。因此，本研究设计了MgIG 干预组，以明确MgIG 是否会阻止肝纤维化进程中肝细胞的病理改 变。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

3月龄健康雄性SD 大鼠16 只，体质量160～180 g，由川北医学院动物实验中心提供，将大鼠适应性饲养1 周后，随机分为3 组：对照组（n=5）、模型组（n=6）、治疗组（n=5）。

对照组，大鼠背部皮下注射3 mL/kg 的生理盐水，2 次/周，并同时腹腔注射生理盐水30 mL/kg，1 次/天，连续注射5 周。

模型组，根据参考文献[9]制备，将CCl4（国药集团化学试剂有限公司）与橄榄油（国药集团化学试剂有限公司）按体积比2∶3 配成40% CCl4-橄榄油混悬液，按3 mL/kg 的剂量在大鼠背部皮下注射，2 次/周，并同时腹腔注射生理盐水30 mL/kg，1 次/天，连续注射5 周。

治疗组，从CCl4造模开始同时给予腹腔注射30 mL/kg 的MgIG（江苏正大天晴药业有限公司），1 次/天，连续注射5 周。

1.2 组织处理与切片制备

将大鼠予以腹腔注射3%戊巴比妥（50 mg/kg）进行麻醉，剪取一小块肝组织切成1 mm3大小的组织块放入2.5%戊二醛固定，用于制作电镜超薄切片。剩余肝组织放入4%的多聚甲醛（成都市科龙化工试剂厂）浸润固定48 h后用于制备石蜡包埋切 片。

1.3 肝密度与体积测量

采用电子天平（精度0.1 mg））称量肝质量，并用已知密度的不同浓度的蔗糖或乙醇溶液测量肝密度，具体测量方法如下：利用超纯水、蔗糖和无水乙醇配制出不同浓度蔗糖溶液与乙醇溶液，由于浓度不同，其比重亦不同。将待测肝缓慢放入不同比重溶液中，观察其浮沉情况：若在溶液中悬浮（既不沉入溶液器皿底部也不浮出溶液表面），此时溶液密度即为肝密度。该大鼠肝总体积可由所测肝质量除以密度得到。

1.4 石蜡切片制备

每只大鼠按照等距抽样抽选4 个2 mm 厚的肝组织块行石蜡包埋，每个组织块用半自动石蜡切片机切取2 张14 μm 厚的石蜡切片，采用Masson染色方法染色肝组织切片。Masson 染色步骤：按照Masson 三色染色试剂盒（福州迈新生物技术公司）说明书进行。切片脱蜡处理至水，试剂 A 染色5 min，PBS 液冲洗，再滴加 1 滴试剂 C（磷钼酸）5 min，甩干后滴加 1 滴试剂 D（苯胺蓝）染色 5 min，PBS 液冲洗，滴加 1 滴分化液（试剂 B）分化 30 s；甲苯胺蓝复染细胞核5～10 s；70%乙醇、无水乙醇脱水，透明，封片。

1.5 肝细胞及肝细胞胞质内脂滴总体积的估计

采用体视学设备New Cast 系统（配有BX53 型生物显微镜）在电脑显示器上显示Masson 染色的肝组织显微切片图像（100 倍物镜，最后放大倍数为2 240 倍），用电动载物台等距随机抽选测试视野（X 和Y 轴视野间距长均设定为1 200 μm），并运用测试系统软件在视野上生成3×3 测点（即3 排共9个等距排列的测点，每个点面积为1 625.59 μm2）。首先从肝组织切片的左上角随机抽取第一个视野，然后按照1 200 μm 的移动步距（等距方式）手动抽选测试视野，分别计数落在肝细胞、肝细胞胞质内脂滴的测点数及整张切片内的测点总数。将肝细胞的测点数或肝细胞内脂滴的测点数除以整张切片内的测点总数，得到肝细胞或肝细胞内脂滴的体积占肝总体积的百分比，即体积分数；将之乘以肝总体积，即得肝细胞与肝细胞胞质内脂滴的总体积。

1.6 每个肝细胞平均体积及肝内肝细胞数量的估计

运用体视学设备New Cast 系统在Masson 染色的肝组织切片上随机抽选7 个视野，并运用测试系统软件在视野上生成3×3 测点，采用点取截距法测量测点落在肝细胞上的直径，并算出肝细胞的平均直径，每个肝细胞的体积无偏估计为。

将大鼠肝内肝细胞的总体积除以每个肝细胞的平均体积可以估计肝内肝细胞数量的变化趋势。

1.7 统计学处理

采用SPSS 13.0 软件分析统计数据，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素重复检测的方差分析，并结合 Student-Newman-Keuls 法进行两两对比，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCl4对肝细胞形态和胶原纤维分布的影响

对照组大鼠肝细胞呈六边形，肝细胞核居中。肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，形成肝索，极少量肝细胞内可见脂滴。肝组织汇管区可见少量胶原纤维。模型组大鼠肝细胞明显水肿、脂肪变性，肝细胞内可见较多脂滴，部分肝细胞核被挤压至肝细胞一侧，肝细胞排列紊乱。肝组织内胶原纤维明显增生，形成大量纤维间隔，部分假小叶形成。治疗组大鼠肝细胞大量水肿变性，肝细胞明显脂肪变性，肝细胞胞质内可见大小不等的脂滴，肝组织胶原纤维显著增生，分割正常肝小叶，部分形成假小叶（图1）。

图1 Masson 染色示大鼠肝组织内胶原纤维

2.2 MgIG 对肝细胞平均体积和总体积及细胞总量的影响

与对照组比较，模型组、治疗组大鼠肝细胞的总体积无显著变化；与模型组比较，治疗组大鼠肝细胞的总体积无显著变化（表1）。

与对照组比较，模型组、治疗组大鼠肝细胞平均体积均显著增加，分别增加了91.9% 和105.0%；与模型组比较，治疗组大鼠肝细胞平均体积无显著变化（表1）。

与对照组比较，模型组、治疗组大鼠肝细胞总数量均显著减少，分别减少了40.0% 和42.4%；与模型组比较，治疗组大鼠肝细胞总数量无显著变化（表1）。

表1 各组大鼠肝细胞总体积、平均体积及细胞总数量的比较（±s）

表1 各组大鼠肝细胞总体积、平均体积及细胞总数量的比较（±s）

*P＜0.05 vs 对照组

组别肝细胞总体积×1012 μm3肝细胞平均体积×103 μm3肝细胞总数量×108对照组6.81±1.326.67±0.7510.40±2.90模型组8.21±2.1212.80±1.02*6.24±1.70*治疗组7.14±1.8613.70±5.50*5.99±2.72*

2.3 MgIG 对肝细胞胞质内脂滴总体积的影响

对照组、模型组与治疗组肝细胞胞质内脂滴总体积分别为6.30±6.97、39.5±14.6、36.7±10.5（×109μm3）。

与对照组比较，模型组、治疗组大鼠肝细胞胞质内脂滴的总体积均显著增加，分别增加了5.27 倍与4.83 倍；与模型组比较，治疗组大鼠肝细胞胞质内脂滴的总体积无显著变化。

3 讨论

体视学是定量形态学以及形态结构的抽样估计的科学[10]。本研究采用了无偏体视学方法结合光镜技术，首先利用重量除以密度得到大鼠总体积，然后对大鼠肝按照等距随机抽样原则进行抽样。由于纳入体视学测试的肝组织是通过等距随机抽样的方式获得，因此通过抽样获得的肝组织块能够代表大鼠整个肝的变化。其次，采用点计数得到大鼠肝细胞与肝细胞胞质内脂滴的体积分数。最后分别将肝细胞与肝细胞胞质内脂滴的体积分数与大鼠肝总体积相乘，即为肝细胞与肝细胞胞质内脂滴的总体积。将肝细胞总体积除以每个肝细胞平均体积可以估计肝内肝细胞数量的变化趋势。

CCl4是经典的诱发肝纤维化的一种选择性肝毒性药物，CCl4进入肝后在肝细胞内经微粒体细胞色素P450 氧化酶激活后，生成活泼的三氯甲基自由基并引发脂质过氧化作用，导致肝细胞变性（如细胞气球样变、细胞脂肪变性等）、坏死，长期反复刺激导致肝组织纤维化[11-12]。本研究采用每周2 次给予大鼠背部皮下注射CCl4的方式，致肝细胞反复损伤、坏死，肝内广泛ECM 过度增生与异常沉积，形成肝纤维化。本研究结果显示，CCl4诱导的肝纤维化大鼠每个肝细胞平均体积显著增加了91.9%，肝细胞胞质内脂滴总体积增加了5.27 倍，肝细胞总数量减少了40.0%，肝细胞总体积则无明显变化。分析其原因可能是由于CCl4的肝毒性作用致部分肝细胞变性，肝细胞大量脂肪变性，细胞水肿，单个肝细胞平均体积增大，部分肝细胞坏死，肝细胞数量减少，因此在肝纤维化过程中，尽管肝细胞平均体积显著增大，肝细胞总体积无显著性变化。肝细胞数量的减少以及大量脂肪变性伴随着肝功能的损伤甚至衰竭。本研究结果显示，CCl4致大鼠肝内肝细胞总数量显著减少以及肝细胞胞质内脂滴体积显著增加，从形态定量角度证实了CCl4所致大鼠肝纤维化伴随着肝细胞肿胀、脂肪变性及肝细胞数量减少等病理改变，CCl4具有较强的肝毒性作用。

MgIG 是临床中常用的保肝药物之一，其有效成分为18α 甘草酸，具有抗炎和稳定肝细胞膜的功能。有研究表明，MgIG 能通过降低肝纤维化大鼠肝细胞脂质过氧化水平，提高超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽的表达，从而降低氧化应激水平，改善肝纤维化[13]。但是本研究的形态定量结果并未见MgIG 对CCl4诱导的大鼠肝细胞损伤的病理改变指标有明显的改善作用，肝细胞的总体积、肝细胞胞质内脂滴的总体积、肝细胞平均体积及肝细胞总数量与模型组均无显著差异。该结果提示，MgIG 没有明显促进肝细胞再生与减轻肝细胞脂肪变性的作用。分析MgIG 没有改善CCl4致肝细胞病理改变的原因可能由于本研究采用的每周2 次给予大鼠背部皮下注射CCl4诱导肝纤维化，同时每天1 次腹腔注射MgIG 进行干预，CCl4对大鼠肝存在反复损伤，而临床上MgIG 治疗药物性肝炎时，会停用一切损伤肝的药物。这也说明如果损伤肝的因素未祛除，即使使用MgIG 干预，仍不能阻止肝纤维化大鼠肝细胞的病理改变。