塞来昔布对类风湿关节炎大鼠肿瘤坏死因子-α信号通路及滑膜细胞的影响

王俊苹 杜健磊 李 慧

（1 驻马店市中心医院药学部，驻马店 463000；2 河南大学附属医院风湿免疫科，开封 475000）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）属于自身免疫系统疾病，如不进行手术或者有效治疗可导致关节病变，影响行动能力[1]。据不完全统计，全球每年RA 患者新增人数超过1 百万，且男女比率失调，40～50 岁女性较多，这可能与更年期钙流失有关[2]。有研究发现，RA 疾病的产生会导致一些心脑血管及肺疾病产生，影响患者生命质量[3]。成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）对RA 机体关节组织具有多种活性作用，在RA 病变过程中常表现为异常活化增殖，诱导关节肿胀及炎症反应。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）可通过激活多种信号诱导其他细胞因子参与RA 炎症反应中。近几年，临床针对TNF-α 的抑制药物不断更新，并逐渐应用于RA 疾病的治疗中，取得较好的效果[4]。塞来昔布是一种COX-2 类抑制剂，抑制作用较强，并对患者肠胃代谢功能无明显毒副作用[5]，但对RA 患者病变位置的滑膜细胞及TNF-α 信号的影响目前研究较少。因此，本研究建立RA 大鼠模型，观察塞来昔布对其滑膜细胞及TNF-α 水平的影响。

1 材料和方法

1.1 动物与分组

购自郑州大学实验动物研究中心的36 只SPF级SD 雄性大鼠，体质量200～250 g，适应周围环境后，随机数字法分为3 组，分别为正常大鼠（正常对照组），建立RA 模型（RA 组）及建立RA 模型后灌胃塞来昔布（实验组），每组12 只。

1.2 主要试剂盒仪器

塞来昔布胶囊（辉瑞制药，国药准字：J20110099）；TNF-α、β-actin 抗体（诚研生物）；H-E染色、TUNEL 试剂盒（上海胜隆）。

1.3 RA 大鼠模型建立

RA 组和实验组大鼠的足爪、背部及尾根处均注射稳定性Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂共0.35 mL。首次诱导时间为7 d，接着对大鼠的足部进行皮下加强注射一次，每次的剂量为0.15 mL。对照组大鼠在相同部位注射同体积的0.9%氯化钠溶液。RA组和实验组建立模型[6]。

1.4 给药及组织提取

建模成功7 d后，实验组大鼠灌胃4 mg·kg-1·d-1塞来昔布，其余2 组灌胃同体积的生理盐水，连续灌胃30 d。灌胃结束检测关节炎指数后安乐死大鼠，分离膝关节组织，低温保存，用于后续实验。

1.5 观察各组大鼠关节炎指数（MAI）

采用MAI评分法，建模7 d后作为第1天，每4 d检测3 组大鼠MAI 评分程度（表1）。

表1 MAI 评分

1.6 H-E 染色观察病理

麻醉处死大鼠（1%戊巴比妥钠），提取膝关节组织自来水冲洗污血，放入液氮保存。10%甲醛溶液固定组织过夜，自来水冲洗，浸泡于14%的EDTA 溶液中脱钙，逐级脱水后石蜡包埋后4 μm 切片后备用。组织切片放入37℃复温15 min，二苯甲脱蜡后经乙醇进行逐级入水，苏木精染色10 min，1%盐酸处理，伊红复染，封片后观察组织形态。

1.7 TUNEL 检测

取3 组大鼠膝关节滑膜组织进行浸蜡包埋制做石蜡切片，厚度为2 μm，切5 张切片，按TUNEL试剂盒说明书将切片进行染色，每张切片选择不重复的5 个方位进行观察，滑膜细胞凋亡计算：凋亡细胞/总细胞×100%。

1.8 免疫印迹检测TNF-α 蛋白

膝关节组织经1%裂解液处理，采用BCA 检测蛋白，加入样品后，进行SDS-PAGE 电泳，转移至PVDF 膜，封闭1.5 h，后加入一抗TNFα（1∶1 000），内参为GAPDH（1∶2 000），过夜加入辣根过氧化酶标记的二抗（1∶2 000），摇匀，采用TBST 冲洗膜，最后ECL 化学发光显色，实验重复3 次取平均值。

1.9 免疫组织化学检测TNF-α 阳性表达

膝关节组织采用甲醛固定，石蜡包埋，切片水化后，37.5 ℃静置0.5 h，加入1% EDTA 液，山羊血清封闭。加入一抗TNF-α 抗体（1∶500），4 ℃孵育24 h 漂洗后加入二抗（1∶2 000）0.5 h后，复染，封片。选择不交叉的10 个视野，以淡黄色至棕褐色为阳性，计算阳性数。阳性细胞数记分标准：0 分：无染色或细胞染色程度＜10%；1 分：10%～50%细胞呈现轻度或中度染色；2 分：10%～50%细胞强度染色；3 分：＞50%细胞呈强度染色；0 分为阴性；1～3 分为阳性。

1.10 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件对数据进行分析，各组MAI、病理改变、滑膜细胞凋亡及TNF-α 蛋白及阳性表达的差异性采用t检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组大鼠关节炎症指数比较

建模后，对大鼠关节炎症指数进行评价，在13 d 时评分升高后降低，从急性炎症期转到慢性期；在23 d、30 d 时与RA 组相比，实验组关节炎症指数显著降低（P＜0.05），且RA 组、实验组关节炎症指数显著高于对照组（P＜0.05）（图1）。

图1 3 组大鼠关节炎症指数比较

2.2 塞来昔布对大鼠病理改变的影响

对照组膝关节滑膜组织滑膜细胞呈单层生长，未出现增生，关节腔内无渗出，未见明显炎症。RA 组滑膜组织出现坏死，炎症严重，明显滑膜增生，软骨损伤。实验组经塞来昔布灌胃处理后，滑膜肿大减少，只见少量炎症细胞浸润（图2）。

图2 塞来昔布对3组大鼠病理组织的影响，×200。A：对照组；B：RA组；C：实验组，箭头所指为病理表现.

2.3 塞来昔布对滑膜细胞凋亡的影响

对照组滑膜细胞凋亡率6.65%高于RA 组1.73%（P＜0.05）；实验组滑膜细胞凋亡率为14.65%，高于RA 组，说明对RA 大鼠灌胃塞来昔布会增加滑膜细胞凋亡，改善病情（图3）。

图3 大鼠滑膜细胞凋亡图，×200。A：对照组；B：RA组；C：实验组.

2.4 塞来昔布对大鼠滑膜组织中TNF-α蛋白表达的影响

对照组滑膜组织中TNF-α 蛋白表达量少于RA组（P＜0.05），实验组滑膜组织中TNF-α 蛋白表达量少于RA 组，说明塞来昔布能够减低RA 大鼠滑膜组织中TNF-α 水平（图4）。

图4 大鼠滑膜组织中TNF-α的蛋白表达量。*P＜0.05 vs 对照组；#P＜0.05 vs RA组.

TNF-α 在滑膜组织中呈现棕黄色表达，RA组大鼠滑膜组织中TNF-α 阳性表达高于对照组（P＜0.05），实验组大鼠滑膜组织中TNF-α 阳性表达低于RA 组（P＜0.05），说明塞来昔布能够降低TNF-α 阳性表达（图5、6）。

图5 大鼠滑膜组织中TNF-α 阳性表达，×200。A：对照组；B：RA 组；C：实验组.

图6 3 组大鼠滑膜组织中TNF-α 阳性表达的比较。*P＜0.05 vs 对照组；#P＜0.05 vs RA 组.

3 讨论

RA 是以滑膜炎为主的系统性慢性疾病，中年女性为易发人群，我国发病率为0.35%左右。多数研究表示，RA 发病机制尚不明确，但与基因、环境等因素改变有关，患者出现破坏性关节炎症等[7]。大量研究显示，滑膜细胞在维持关节平衡方面具有关键作用。RA 患者机体滑膜细胞较为活跃，能够分泌多种炎症因子，损伤软骨，恶化病情[8]。TNF-α 是促炎症细胞因子，有研究表明，TNF-α 在RA 疾病发生及发展中发挥关键作用[9]。本研究通过建立RA 大鼠模型观察塞来昔布对RA 大鼠滑膜细胞及TNF-α 信号通路的影 响。

塞来昔布是医学界首次发现的COX-2 抑制剂，COX-2 主要在滑膜细胞细胞质及细胞膜中表达，在机体炎症升高时可促进前蛋白转化酶（proprotein convertases，PCs）水平升高[10]。塞来昔布对COX-2抑制程度是COX-1 的300 倍以上。大量动物RA 实验研究表明，经塞来昔布灌胃能够缓解大鼠足爪水肿炎症程度，将PCs 恢复至正常水平[11]。本研究结果表示，塞来昔布灌胃30 d 能够有效缓解实验组大鼠的关节炎症指数。COX-2 高表达能够快速转化为前列腺素2，可释放细胞炎症因子，发生炎症效应，加快血管水肿。塞来昔布能够抑制COX-2 活性，减少COX-2 转化成炎症因子，发挥消炎止痛的作用[12]。

RA 病理特征主要表现为滑膜细胞增多及炎症细胞浸润，诱导滑膜增厚，导致软骨组织损伤，关节病变[13]。滑膜细胞在RA 病变中表现为异常活化状态，是诱导关节损伤的主要效应细胞[14]。本研究通过对RA 大鼠灌胃塞来昔布，滑膜细胞出现大量凋亡，并减少了滑膜组织中滑膜细胞肿大。塞来昔布能够间接对前列腺素2 及血栓素活性进行抑制，减少滑膜细胞进行信号转导及炎症表达，进一步控制滑膜细胞炎症浸润，缓解RA 患者病情发生发展[15]。Kraus 等[16]研究表明，抑制COX-2 可促进滑膜细胞死亡及破裂，这与本研究结果相似。

在RA 滑膜中TNF-α 表达活跃，可通过NF-κB信号激活IL-1β 等炎症因子，活化的炎症因子也能刺激NF-κB 信号，相互作用，形成了RA 炎症反应机制。TNF-α 可以形成一种自身免疫炎症反应，加重关节损伤[18]。塞来昔布能够降低疼痛因子PCs 水平，RA 患者PCs 水平上升可激活TNF-α，而塞来昔布的作用机理是通过抑制TNF-α 水平表达，改善RA 患者肿胀疼痛[19]。而塞来昔布作为一种COX-2特异性抑制剂，能够抑制IL-1β 和TNF-α 水平，改善透明软骨特征性Ⅱ型胶原的生长合成，避免使其结构性蛋白变质对软骨细胞造成巨大的破坏[20]。塞来昔布抑制TNF-α 的机制目前仍不明确，笔者认为，主要机制可能在于塞来昔布选择性抑制COX-2的活性，而COX-2 及TNF-α 之间可相互作用，促进炎症的发生。塞来昔布抑制TNF-α 的促炎作用降低RA 的炎性反应。杨安忠等[21]研究表明，对RA患者给予塞来昔布治疗后可降低体内炎症水平，本研究与之研究结果相似。

综上所述，塞来昔布能改善RA 大鼠关节炎症指数，促进滑膜细胞坏死，降低TNF-α 表达，改善病情。