仔猪致泻性大肠杆菌毒力因子多重PCR检测方法的建立与应用

毕斓婷，冀亚路，袭恒豫，张 昊，陈椿桦，姜秋杰，付殿国，牛 伟，孙长江，冯 新，吕 伟，顾敬敏*，韩文瑜* (.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 006;.吉林省动物疫病预防控制中心,吉林 长春 006；.吉林农业科技学院 动物科技学院，吉林 吉林市 0；.吉林省公主岭市鑫源木业，吉林 公主岭 600)

仔猪的肠道微生态系统尚未稳定建立，易受病原微生物侵袭，主要症状为仔猪腹泻，特别是在断奶仔猪则更为明显。细菌性腹泻大多由致病性大肠杆菌引起，可引起腹泻的致病性大肠杆菌包括肠道致病性大肠杆菌(EPEC)、肠道产毒素性大肠杆菌(ETEC)、肠道侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠道出血性大肠杆菌(EHEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)，以及肠产志贺样毒素同时具有一定侵袭力的大肠杆菌(ESIES)和肠道集聚性的黏附大肠杆菌(EAggEC)[1]。其中以ETEC为主， ETEC产生的毒力因子中肠毒素和黏附素起着重要的作用。肠毒素一般可分为耐热肠毒素(ST)和热敏肠毒素(LT)，两种肠毒素既可单独产生，又可同时产生，且与LT相比，ST在由ETEC引起的幼畜腹泻性疾病中具有重要地位。ST又分为耐热肠毒素Ⅰ型(STa)和耐热肠毒素Ⅱ型(STb)[2]。肠凝集性大肠杆菌耐热肠毒素Ⅰ(EAST1)最早发现于EAggEC中，后又在EPEC、ETEC、EHEC和EAEC中被发现[3]，其主要毒力基因为astA。为探究常见毒力因子在导致仔猪腹泻的大肠杆菌中的检出率，通过对反应退火温度、酶和引物添加量的优化，建立一种针对仔猪致泻性大肠杆菌(DEC)常见毒力因子的多重PCR检测方法，并应用于吉林省各猪场常见毒力因子的快速检测及分子流行病学调查。

1 材料与方法

1.1 主要材料大肠杆菌参考菌株ATCC-35401，2020年分离自吉林省31个猪场腹泻仔猪肛拭子的881株大肠杆菌。G1000基因扩增仪(杭州博日科技有限公司)；DYY-8C型电泳仪(北京市六一仪器厂)；琼脂糖(bioweste regular agarose G-10)；50×TAE,DL500 DNA Marker；DL1000 DNA Marker均购自TaKaRa公司。

1.2 引物的设计与合成根据GenBank中公布的大肠杆菌EAST1[4]、LT、STa[5]和STb基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 PCR引物信息

1.3 DNA模板的制备将猪场采集的样品，通过麦康凯培养基和伊红美蓝选择培养基培养，挑取单个菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜，采用煮沸法提取待检菌株的DNA为模板[6]。

1.4 单一PCR方法的建立以大肠杆菌参考菌株ATCC35401为模板分别对4种毒力因子建立PCR方法。反应体系为25 μL：上、下游引物(1 μmol/L)各0.5 μL，模板1 μL，rTaq酶12.5 μL，加ddH2O至25 μL。将反应中退火温度设置梯度(51.0，51.7，52.6，53.9，55.4，57.2，58.9，60.1，61.1，61.7℃)，反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性20 s，梯度退火温度20 s，72℃延伸40 s，35个循环；72℃终延伸5 min。扩增产物用3%琼脂糖凝胶电泳检测，90 V电泳30 min。

1.5 多重PCR方法的建立以大肠杆菌参考菌株ATCC35401为模板对4种毒力因子建立多重PCR方法。反应体系为25 μL：上、下游引物(1 μmol/L)各0.5 μL，模板1 μL，rTaq酶12.5 μL，加ddH2O至25 μL。按照建立的单一PCR反应进行扩增，扩增产物用3%琼脂糖凝胶电泳检测，90 V电泳30 min。

1.6 多重PCR方法的优化以大肠杆菌参考菌株ATCC35401为模板，对已建立的多重PCR方法进行优化。分别通过改变酶和引物加入量以及退火温度来实现。rTaq酶添加量的优化：反应体系中rTaq酶添加量依次为10.0，10.5，11.0，11.5，12.0，12.5，13.0 μL。引物加入的量的优化：反应体系中引物添加量依次为0.25，0.50，0.75，1.00，1.25 μL。退火温度的优化：退火温度依次设置为51.0，51.7，52.6，53.9，55.4，57.2，58.9，60.1，61.1，61.7℃。

1.7 多重PCR方法的特异性测试为验证上述建立的多重PCR方法的特异性，按建立好的多重PCR反应，以大肠杆菌参考菌株ATCC35401、李斯特菌标准菌株ATCC1911、沙门菌标准菌株ATCC14028、金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC26003和ATCC44515及大肠杆菌功能菌株DH5α的细菌基因组DNA为模板进行扩增反应。

1.8 多重PCR方法的敏感性测试为验证上述建立的多重PCR方法的特异性，按建立好的多重PCR反应，以大肠杆菌参考菌株ATCC35401为模板，10倍倍比稀释DNA模板浓度，使模板质量浓度为132.90～1.33×10-5mg/L，进行扩增反应。

1.9 吉林省仔猪DEC常见毒力因子的分子流行病学调查应用建立的多重PCR方法对2020年从吉林省31个猪场腹泻仔猪肛拭子中分离的881株大肠杆菌进行检测。

2 结果

2.1 单一PCR方法的建立使用表1的引物分别对携带4种毒力因子的大肠杆菌参考菌株ATCC35401的基因组DNA进行单一PCR扩增。结果显示，4种毒力因子均能在大肠杆菌参考菌株ATCC35401的基因组DNA中扩增出目的条带，且均与预期相符(毒力因子EAST1、STa、STb和LT产物长度分别为111，158，216，348 bp)(图1)。

A.EAST1单一PCR方法的建立；B.STa单一PCR方法的建立；C.STb单一PCR方法的建立；D.LT单一PCR方法的建立。M.DL1000 DNA Marker；1～10.退火温度分别为51.0，51.7，52.6，53.9，55.4，57.2，58.9，60.1，61.1，61.7℃

2.2 多重PCR方法的建立使用表1的引物对携带4种毒力因子的大肠杆菌参考菌株ATCC35401的基因组DNA进行多重PCR扩增。结果显示，在111，158，216，348 bp处出现4条特异性目的条带。4种毒力因子均能在大肠杆菌参考菌株ATCC35401的基因组DNA扩增出目的条带，目的条带与预期大小符合，条带清晰且无非特异性扩增(图2)。

2.3 多重PCR方法的优化对多重PCR方法酶添加量的优化见图3A，不同添加量的rTaq酶均可扩增出目的条带，根据目的条带的明暗可以看出，rTaq酶的添加量在12.5～13.0 μL最为合适；对多重PCR引物添加量的优化见图3B，不同添加量的引物均可扩增出目的条带，根据目的条带的明暗可以看出，引物的添加量在0.25～0.50 μL最为合适；对多重PCR退火温度的优化见图3C，退火温度为51.0～61.7℃ 时，4种毒力因子均可扩增出与预期大小相符的目的条带，且在61.1℃时，扩增出的目的条带最明亮。

2.4 多重PCR方法的特异性检测用所建立的多重PCR方法进行特异性检测， 结果显示(图4) ，所建立的多重PCR方法只能特异性扩增大肠杆菌参考菌株ATCC35401，而其他菌扩增结果均为阴性，说明所建立的方法特异性良好。

2.5 多重PCR方法的敏感性检测用所建立的多重PCR方法进行敏感性检测，结果显示(图5)，在模板质量浓度为13.29 mg/L时有特异性扩增条带，因此该方法检测的最低检出质量浓度为13.29 mg/L。

M.DL1000 DNA Marker；1～10.按照单一PCR反应进行10次重复试验

A.rTaq酶添加量的优化(1～7.10.0,10.5,11.0,11.5,12.0,12.5,13.0 μL)；B.引物添加量的优化(1～5.0.25,0.50,0.75,1.00,1.25 μL)；C.退火温度的优化(1～10.退火温度分别为51.0,51.7,52.6,53.9,55.4,57.2,58.9,60.1,61.1,61.7℃)。M.DL1000 DNA Marker

M.DL1000 DNA Marker；1.大肠杆菌参考菌株ATCC35401；2.李斯特菌标准菌株ATCC1911；3.沙门菌标准菌株ATCC14028；4.金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC26003；5.金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC44515；6.大肠杆菌功能菌株DH5α

M.DL1000 DNA Marker;1.132.9 mg/L;2.13.29 mg/L;3.1.33 mg/L;4.0.13 mg/L；5.1.33×10-2mg/L;6.1.33×10-3 mg/L;7.1.33×10-4 mg/L;8.1.33×10-5 mg/L

2.6 吉林省仔猪DEC的分子流行病学调查结果显示，从31个猪场采到的881株大肠杆菌中，有317株存在所测的4种毒力因子，其中ESAT1占32.01%，LT占3.29%，STa占4.43%，STb占12.03%。EAST1每个猪场都可以检测到且S猪场高达87.50%；LT只在A、C、E、F、G、Z共6个猪场检测到，Z猪场占比最高为18.18%；STa在A、E、F、G、I、K、S、W、Y、LG共10个猪场检测到，E猪场占比最高为27.27%；STb在20个猪场可以检测到，Y猪场占比最高为40.00%。

表2 吉林省各猪场大肠杆菌毒力因子分子流行病学结果 %

3 讨论

临床上导致仔猪腹泻的致病菌主要为DEC，其中以ETEC为主[7]，且仔猪腹泻多为混合感染所致，因此鉴定腹泻仔猪携带的毒力因子可为防控该病提供依据。单一PCR方法过程繁琐且工作量大，不适用于多种毒力因子的检测[8]。本研究建立的多重PCR方法可以快速便捷地鉴定DEC携带的毒力因子，为疾病诊断和分子流行病学研究提供有效措施。

多重PCR反应中影响反应特异性和稳定性的因素有很多，本研究通过选取常见的4种毒力因子作为目标产物建立多重PCR方法并通过改变反应引物添加量、酶添加量和退火温度对该方法进行优化[9]。通过对引物添加量的优化，既可以避免引物浓度过高导致的错配和非特异性，又可以避免引物浓度过低导致的假阴性[10]；通过对酶添加量的优化避免rTaq酶活性过强导致出现非特异性扩增片段[11]；通过对退火温度的优化提高PCR扩增的特异性，且在退火温度允许的范围内，较高的退火温度特异性较强[12]；还有其他条件的优化，比如为避免出现多重PCR的扩增产物在低浓度凝胶中难以分离的情况，将凝胶浓度优化为3%[13]。最终确定反应体系为25 μL：上、下游引物(1 μmol/L)各0.5 μL，模板1 μL，rTaq酶12.5 μL，加ddH2O至25 μL。反应条件：95℃预变性5 min;95℃变性20 s，61℃退火20 s，72℃延伸40 s，35个循环；72℃终延伸5 min。

本研究建立的多重PCR方法检测的最低检出质量浓度为13.29 mg/L，适用于大多数采集到的大肠杆菌的基因组DNA模板。特异性测试显示该方法对李斯特菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌功能菌株DH5α的细菌基因组DNA扩增效果均为阴性，说明该方法具有较高的特异性。为评估该方法的可行性和准确性，从猪场采集的大肠杆菌样品中随机选取100株进行单一PCR和多重PCR检测，2次检测到的毒力因子结果一致，说明该多重PCR方法的检测结果可靠[6]。

本研究从881株大肠杆菌中，检测出317株大肠杆菌至少携带1种毒力因子，检出率为35.98%，高于张敏等[14]得出的四川省DEC检出率(29.6%)和李月华等[15]得出的西南地区检出率(26.92%)，这可能与猪场的卫生防疫和生物安全有关。检出率高的猪场要建立猪场生物安全体系，落实各项防控措施，做好消毒[16]与免疫管理[17]。本研究发现，在大肠杆菌常见的毒力因子中EAST1检出率最高甚至在S猪场中高达87.50%，鉴于EAST1毒力因子是多种DEC的共同毒力因子,结合本研究检测的另外3种毒力因子的检测结果，发现仔猪腹泻大多是由多种DEC混合感染所致。

综上所述，本研究建立的多重PCR检测方法可以同时检测DEC携带的4种毒力因子且具有较好的特异性与准确性，适用于大量样本的检测且成本较低、操作简单。在后续深入研究中将着力引物特异性提升，提高该方法的敏感性避免模板浓度低导致的假阴性。