GC-MS和GC-FID定性定量分析毒品中曲马多、芬太尼、地芬诺酯成分

杨发震 鲁志强 沈 松 陈 康 李绍鹏 柴育芳 苏少明

（1 毒品分析及禁毒技术公安部重点实验室 云南 昆明 650228；2 玉溪市公安局刑事科学技术研究所 云南 玉溪 653100；3 昆明医科大学法医学院 云南 昆明 650500）

1 引言

曲马多是一种阿片受体激动剂和常用的中枢性镇痛药，易产生不良反应，存在滥用的可能性[1]，与传统毒品等相比，曲马多价格便宜、获取途径方便，近年被一些不法分子作为传统毒品的替代品来使用[2]；曲马多的体内代谢产物主要为O-去甲基曲马多（ODT）、N-去甲基曲马多（NDT）、N,O-去甲基曲马多（NODT）[3]。

芬太尼作为一种阿片受体激动剂，具有强效麻醉作用，药效约为吗啡的50～100倍，海洛因的30～50倍，主要用于外科麻醉和癌症患者疼痛的治疗。芬太尼在血浆中的治疗水平可低至1ng/mL，其主要代谢物为诺芬太尼[4-5]，仅在2013～2014年间，美国就有700多人死于芬太尼和芬太尼类似物，芬太尼被添加到海洛因中的历史可追溯到1979年，目前白色海洛因、黒焦油海洛因中均有检测到芬太尼及芬太尼类似物的报告[6-8]。

地芬诺酯为吗啡的人工合成代用品、哌替啶的衍生物，长期服用可形成依赖，常被吸毒人员作为海洛因替代品吸食滥用，其中毒量与治疗量较为接近，且它的代谢产物地芬诺辛毒性更强，过量服用极易引起中毒甚至死亡。随着我国对阿片类传统毒品打击力度的增强和戒毒工作的持续深入，目前地芬诺酯的滥用情况呈现出愈发严重的态势[9-11]。据相关报道，在伊朗销售的许多阿片类药物戒断药的中草药中，从大量样品中检出了曲马多、美沙酮和地芬诺酯成分[12]。近几年，世界多国的不法分子将曲马多、芬太尼和地芬诺酯等非法添加到中草药中，制成不同颜色的复方胶囊进行非法贩卖，或单独非法贩卖制成不同颜色胶囊的地芬诺酯单方制剂，用来作为阿片类毒品戒断药物或者新型毒品销售贩卖，并且已有因吸食该类药品过量死亡案件的发生。

对于在全血、血浆、尿液、毛发等生物样品中，对曲马多、芬太尼、地芬诺酯一种或多种成分的检测，目前主要采用气相色谱-质谱法（GC-MS）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS）、液相色谱-高分辨质谱法 （LC-HRMS）、气相色谱-高分辨质谱法（GCHRMS）及毛细管电泳法（CE）等[3,5,13-20]；对于片剂、针剂溶液等体外样品，主要采用高效液相色谱法（HPLC法）、毛细管电泳法（CE）等对曲马多、芬太尼、地芬诺酯一种或两种成分进行测定[12,21-25]，尚未见到有同时针对体外检材中曲马多、芬太尼、地芬诺酯3种成分同时进行定性定量测定的报道，尤其是针对毒品样品。基于此，本实验将建立采用气相色谱-质谱法（GC-MS）定性、气相色谱法（GC-FID）定量的检验方法，同时对毒品样品中曲马多、芬太尼、地芬诺酯3种成分定性定量分析。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂和材料

Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用系统（美国Agilent 公司），Agilent 7890A-FID气相色谱系统（美国Agilent 公司），Purelab Flex纯水系统（英国ELGA公司），MS 105分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），KQ-50DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

盐酸曲马多（标准品，购于中国药品生物制品检定所），枸橼酸芬太尼（标准品，购于中国食品药品检定研究院），盐酸地芬诺酯（化学对照品，购于中国药品生物制品检定所），普罗地芬盐酸盐（标准品，购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司），甲醇（HPLC级，购于美国Fisher Scientific公司）。

用甲醇准确配置浓度为1.0mg/mL的曲马多、芬太尼、地芬诺酯单标标准储备液，于-20℃恒温避光保存，用于回收率添加测试；用甲醇准确配置浓度为1.0mg/mL的普罗地芬标准储备液，于-20℃恒温避光保存，用于内标溶液；取适量1.0mg/mL普罗地芬标准储备液用甲醇稀释为0.1mg/mL的内标工作液，备用。实验时，用0.1mg/mL的内标工作液准确配置浓度为1.0mg/mL的曲马多、芬太尼、地芬诺酯混标标准储备液，于-20℃恒温避光保存，并用0.1mg/mL内标工作液稀释成系列浓度的混标工作液，以供线性、检出限、定量限等相关测试使用。

2.2 毒品样品

毒品样品为某市公安局于2019年3月至2019年12月期间从涉毒人员、街头毒贩和贩毒集团中缴获，并委托毒品分析及禁毒技术公安部重点实验室进行检验鉴定，样品抽取后于室温保存。将案件中抽取的58份不同颜色胶囊包装的毒品样品，按照胶囊帽-胶囊体颜色分为6种：蓝色-白色胶囊、棕色-棕色胶囊、红色-白色胶囊、黑色-白色胶囊、蓝色-蓝色胶囊。

6种不同颜色胶囊的毒品中包含24份黄色粉末状中草药毒品样品（编为Y1-Y24号）和34份白色粉末状毒品样品（编为W1-W34号）。在24份黄色粉末状中草药毒品样品胶囊中，有16份毒品样品为蓝色-白色胶囊包装、8份毒品样品为棕色-棕色胶囊包装；在34份白色粉末状毒品样品胶囊中，有9份毒品样品为棕色-棕色胶囊包装、8份毒品样品为蓝色-蓝色胶囊包装、11份毒品样品为红色-白色胶囊包装、6份毒品样品为黑色-白色胶囊包装包装。

2.3 样品前处理

分别准确称取黄色粉末状毒品样品100mg、白色粉末状毒品样品10mg，加适量内标工作液（100μg/mL）溶解，超声提取20min，用内标工作液定容至10mL，摇匀，过0.22μm微孔滤膜后，供GC-MS定性及GC-FID定量分析。

2.4 仪器条件

2.4.1 GC-MS定性分析条件

色谱条件：色谱柱为Agilent HP-5MS毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；载气为高纯氦气；流量（恒流）：1.2mL/min；进样口温度：270℃；传输线温度：280℃；质谱扫描范围：40～500amu；溶剂延迟时间：3.5min；进样量：1μL；分流比：20∶1；程序升温条件：初温100℃，保持2min，以30℃/min升至280℃，保持20min。

质谱条件：离子源温度（EI源）：230℃；四极杆温度：150℃；电子轰击能量：70eV；电子倍增器电压：1695V；质谱扫描范围：40～500amu；扫描速度：1562u/s；溶剂延迟时间：3.5min；运行时间：28min。

2.4.2 GC-FID定量分析条件

色谱柱：色谱柱为Agilent DB-1毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；载气为高纯氮气；流速（恒流）：1.5mL/min；进样口温度：270℃；进样量：1μL；分流比：20∶1；检测器温度：290℃；氢气流量：45mL/min；空气流量：300mL/min；程序升温条件：初温150℃，保持1min，以20℃/min升至220℃，保持5min，以40℃/min升至280℃，保持17min。

3 结果与讨论

3.1 GC-MS色谱条件优化及检出限、定量限测试

由于地芬诺酯出峰时间晚，实验在总运行时间为30min条件下，对不同色谱柱进行初温及升温程序，包括分别以60℃、80℃、100℃、120℃为初温条件（保持1～2min），以常见升温速率（20℃/min、30℃/min）升至280℃后，保持不同时间至运行30min等条件进行优化。结果在上述条件中，只有以初温为100℃、120℃，30℃/min的升温速率升温至280℃时，地芬诺酯能够顺利出峰而不会在色谱柱内保留至下一针出峰，且地芬诺酯在色谱柱的保留时间相差不大。因为在日常分析中，考虑很多常见毒品成分（如甲基苯丙胺、苯丙胺、MDMA、MDA、卡西酮、甲卡西酮、乙卡西酮、2-MMC、2-FMC、3-FMC、4-FMC、2-FA、3-FA、4-FA等）及常见毒品中掺杂剂（如二甲亚砜、烟酰胺、吡拉西坦、巴比妥、麻黄碱、氯麻黄碱）等物质成分出峰时间较早，因而考虑选择在以100℃为初温条件保持2min，之后以30℃/min 升温速率升至280℃的升温程序，以防止其他毒药物成分及常见毒品掺杂剂、添加剂物质的漏筛。图1为100μg/mL混标标准溶液、典型黄色粉末状毒品样品及白色粉末状毒品样品的总离子流色谱图。

图1 100μg/mL混标标准溶液、典型黄色粉末状及白色粉末状毒品总离子流色谱图

色谱条件优化完后，实验对气相色谱-质谱联用（GC-MS）法进行定性分析的检出限（LODs）与定量限（LOQs）进行了测试，用100μg/mL的普罗地芬内标工作液准确配置浓度为1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL的曲马多、芬太尼、地芬诺酯混标标准溶液，进行气相色谱-质谱联用（GCMS）的检出限（LODs）与定量限（LOQs）测试，配置的每个浓度进行平行6次实验，结果见表1。结果显示，在GC-MS检出限与定量限测试中，曲马多的检出限（S/N=3，n=6）为1μg/mL、定量限（S/N=3，n=6）为2μg/mL，芬太尼、地芬诺酯的检出限（S/N=3，n=6）均为2μg/mL、定量限均为（S/N=3，n=6）为5μg/mL。

3.2 GC-FID定量分析

3.2.1 检出限、定量限与线性关系测试

用100μg/mL的普罗地芬内标工作液准确配置浓度为1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL的曲马多、芬太尼、地芬诺酯混标标准溶液，进行GC-FID检出限（LODs）、定量限（LOQs）、线性关系（Linear equations）测试，配置的每个浓度进行平行6次实验。其中，线性浓度范围从10μg/mL～500μg/mL进行测试，线性关系以Area/AreaIS为纵坐标（Area1为目标物峰面积值；AreaIS为内标峰面积值），以浓度为横坐标进行线性拟合。结果如表1所示，GC-FID检出限及定量限测试中，曲马多、芬太尼及地芬诺酯的检出限均为2μg/mL、定量限均为5μg/mL；在10μg/mL～500μg/mL浓度线性范围内，曲马多、芬太尼及地芬诺酯3种化合物均具有良好的线性关系，曲马多线性方程为y=12.523x+0.0149，芬太尼线性方程为y=12.537x+0.0196，地芬诺酯线性方程为y=10.9x+0.003，3种成分相关系数R2均大于0.999。图2为普罗地芬内标及混标标准溶液（100μg/mL）、典型黄色粉末状毒品样品及白色粉末状毒品样品的气相色谱图。

图2 100μg/mL混标标准溶液、典型黄色粉末状及白色粉末状毒品气相色谱图

表1 GC-FID与GC-MS分析中3种目标物的线性、检测限与定量限(n=6)

3.2.2 回收率测试

由于无法获取相同基质的空白样品，本实验回收率采用标准加入法进行测试。分别准确平行称取编号为Y1的典型黄色粉末状毒品样品及编号为W18号的典型白色粉末状毒品样品各6份，按照前述“2.3”进行样品前处理后，供GC-FID测定出目标物及内标峰面积，计算其目标物峰面积与内标峰面积比值，再用“表1”中各目标物线性方程计算出平均含量；再次称取上述样品各18份，根据计算结果，使用含量为1.0mg/mL的曲马多、芬太尼、地芬诺酯单标标准溶液进行标准加入，使编号为Y1的典型黄色粉末状毒品样品中曲马多、芬太尼及地芬诺酯的加入量分别为原始含量的80%、100%和120%，每个浓度平行6次添加；同样使用含量为1.0mg/mL的地芬诺酯标准溶液对编号为W18号的典型白色粉末状毒品样品进行标准加入，使其加入的地芬诺酯的含量为原始含量的80%、100%和120%，每个浓度平行6次添加。添加完成后，按照前述“2.3”进行样品前处理后供GCFID测定并计算其平均含量。回收率计算的公式为：回收率=（测得量-原始量）/加入量×100%，每个浓度添加平行6次实验，结果如表2所示。

表2 典型黄色、白色粉末状毒品中3种目标物的回收率（n=6）

结果显示，编号为Y1的典型黄色粉末状毒品样品中曲马多的回收率（80%，100%，120%）在99.2%～99.6%之间，相对标准偏差在0.39%～0.94%之间，平均回收率为99.5%；芬太尼的回收率（80%，100%，120%）在99.1%～101.3%之间，相对标准偏差在0.41%～1.34%之间，平均回收率为100.3%；地芬诺酯的回收率（80%，100%，120%）在96.2%～101.9%之间，相对标准偏差在0.56%～1.44%之间，平均回收率为98.7%；编号为W18号的典型白色粉末状毒品样品中地芬诺酯的回收率（80%，100%，120%）在99.7%～104.3%之间，相对标准偏差在0.53%～0.94%之间，平均回收率为101.8%。测试结果显示，典型黄色粉末状毒品样品（编号为Y1）和典型白色粉末状毒品样品中（编号为W18）中曲马多、芬太尼和地芬诺酯的平均回收率（R%，n=6）在98.7%～101.8%间，各化合物的相对标准偏差均小于1.50%，说明建立的方法回收率高，定量结果准确、可靠。

3.2.3 准确度与精密度测试

用100μg/mL的普罗地芬内标工作液准确配置浓度为20μg/mL、100μg/mL和500μg/mL的曲马多、芬太尼和地芬诺酯的混标标准溶液，分别连续3日用GC-FID进行测定，每个浓度每日平行测定6次，记录并计算目标物峰面积及内标峰面积比值，用“表1”中所建立线性方程计算出含量，普罗地芬内标物直接用外标单点法进行计算含量，用以评估方法的准确度与精密度。准确度用相对误差来表示，精密度用相对标准偏差（RSD）来表示，测试结果如表3所示。

表3 不同浓度混标溶液中(20、100、500μg/mL) 3种目标物和内标普罗地芬（100μg/mL）的准确度与精密度

结果显示，曲马多连续3日测定的相对误差（n=6）在-0.5%～2.0%之间，连续3日日内精密度（n=6）在0.48%～1.28%之间，日间精密度（n=18）在0.77%～1.40%之间；芬太尼连续3日测定的相对误差（n=6）在-0.3%～4.5%之间，连续3日日内精密度（n=6）在0.35%～1.02%之间，日间精密度（n=18）在0.59%～1.99%之间；地芬诺酯连续3日测定的相对误差（n=6）在0.1%～6.5%之间，连续3日日内精密度（n=6）在0.37%～2.71%之间，日间精密度（n=18）在1.25%～3.28%之间；普罗地芬内标物连续3日测定的相对误差（n=6）在-1.7%～0.4%之间，连续3日日内精密度（n=6）在0.80%～1.30%之间，日间精密度（n=18）为1.34%。整体而言，在准确度与精密度测试中，曲马多、芬太尼、地芬诺酯连续3日测量的相对误差（n=6）在-0.5%～6.5%间，日内精密度（RSD%，n=6）在0.35%～2.71%间，日间精密度（RSD%，n=18）在0.59%～3.28%间，该方法准确度与精密度良好，完全满足定量分析要求。

3.2.4 重复性测试

使用制备好的编号为Y1号的典型黄色粉末状毒品样品溶液和编号为W18号的典型白色粉末状毒品样品溶液，用GC-FID测定并记录目标物峰面积及普罗地芬内标峰面积，计算其目标物峰面积与内标峰面积比值，使用“表1”中所建立线性方程计算出含量并计算相对标准偏差，用来评估该方法的重复性，结果如表4所示。

表4 典型黄色、白色粉末状毒品中3种目标物的重复性测试

结果显示，重复性测试中，编号为Y1号的典型黄色粉末状毒品样品溶液中连续6次测定的曲马多成分平均含量为0.0238mg/mg，相对标准偏差为2.18%；连续6次测定的芬太尼成分平均含量为0.0222mg/mg，相对标准偏差为1.74%；连续6次测定的地芬诺酯成分平均含量为0.0048mg/mg，相对标准偏差为3.14%；编号为W18号的典型白色粉末状毒品样品溶液中连续6次测定的地芬诺酯成分平均含量为0.1959mg/mg，相对标准偏差为2.72%。总体来说，在重复性测试中，典型黄色粉末状毒品样品和白色粉末状毒品样品溶液中曲马多、芬太尼和地芬诺酯的RSD%值在0.31%～1.51%间，所建立的方法测量重复性良好。

3.2.5 稳定性测试

使用制备好的编号为Y1号的典型黄色粉末状毒品样品溶液和编号为W18号的典型白色粉末状毒品样品溶液，分别于0、2、4、6、8、12和24小时测定并记录典型黄色粉末状毒品样品溶液中曲马多、芬太尼、地芬诺酯和普罗地芬内标物的峰面积，以及典型白色粉末状毒品样品溶液中地芬诺酯和普罗地芬内标物的峰面积，计算出平均峰面积和相对标准偏差，用以评估制备样品在24小时内的稳定性，结果如表5所示。

表5 典型黄色、白色粉末状毒品中3种目标物的24h峰面积稳定性

结果显示，编号为Y1号的典型黄色粉末状毒品样品溶液中曲马多、芬太尼、地芬诺酯和普罗地芬的平均峰面积分别为240.5、228.5、40.3、80.4，相对标准偏差在1.03%～3.78%之间；编号为W18号的典型白色粉末状毒品样品溶液中地芬诺酯和普罗地芬的平均峰面积分别为166.8、79.7，相对标准偏差在0.74%～2.52%之间。总体来说，两种毒品样品溶液中测定的RSD%值在0.74%～3.78%之间，所制备的样品溶液在24h内稳定性良好。

3.3 实际样品分析

应用所建立的GC-MS定性和GC-FID定量方法对某市公安局缴获并抽取的58份毒品进行检验，结果如表6所示。

表6 实际案件样品中3种目标物的分析结果（黄色粉末状毒品：Y1-Y24，白色粉末状毒品：W1-W34）

结果显示，在GC-MS定性分析中，24份不同颜色胶囊包装的黄色粉末状毒品样品中均检出曲马多、芬太尼及地芬诺酯成分；在34份不同颜色胶囊包装的白色粉末状毒品中均检出地芬诺酯成分，均未检出曲马多和芬太尼成分。在GC-FID定量分析中，不同颜色胶囊包装的黄色粉末状毒品样品中，蓝色-白色胶囊中曲马多的含量均比棕色-棕色胶囊中含量低，芬太尼的含量则相对高于棕色-棕色胶囊中的含量，地芬诺酯的含量则在0.004mg/mg～0.006mg/mg之间；在34份不同颜色胶囊包装的白色粉末状毒品样品中，每种颜色胶囊中的地芬诺酯含量均不一样，相同颜色含量相仿，其中棕色-棕色胶囊中地芬诺酯含量最高（均高于0.42mg/mg），红色-白色胶囊中地芬诺酯含量最低（均低于0.19mg/mg），黑色-白色和蓝-蓝色胶囊中地芬诺含量在0.23mg/mg～0.28mg/mg间。

4 结论

本实验采用GC-MS定性结合GC-FID定量法，建立了缴获毒品样品中曲马多、芬太尼和地芬诺酯的定性定量分析方法，该方法具有前处理简单、准确、精密度、稳定性良好、回收率高等特点，并且已将该方法成功应用于实际案件缴获的毒品样品中曲马多、芬太尼和地芬诺酯的定性定量检验，可为法庭科学实践提供一定的有益借鉴。