肝细胞癌组织Glypican3和Sonic Hedgehog蛋白表达及其功能分析*

李 欢，李 扬，杜 娟，梅 放，王玉湘，郭丽梅

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝脏最常见的原发性恶性肿瘤，高居我国癌症相关死亡人数的第二位[1]。近年来，针对HCC的分子靶向治疗和免疫治疗取得了新的进展[2]。研究提示磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3，GPC3)[3,4]和声猬蛋白(sonic Hedgehog，Shh)[5,6]可显著促进HCC肿瘤细胞的增殖和分化，调节肿瘤血管新生和免疫微环境，在HCC的发生和进展过程中起到关键作用。Shh蛋白在分泌和信号传导过程中受到GPC3的调控[7]。将GPC3和Shh作为HCC治疗靶点的研究初见成效。靶向GPC3的单克隆抗体和GPC3靶向嵌合抗原受体T细胞能有效杀伤GPC3阳性的HCC细胞，并且在动物模型体内具有较强的抗肿瘤活性[8,9]。临床试验靶向Shh的单克隆抗体已用于包括HCC在内的多个癌肿的治疗，显示出抑制肿瘤生长和转移的效果，为研究提供了一种卓有前途的治疗选择[5,10]。但GPC3和Shh蛋白在HCC癌组织中的表达及可能的相互作用还鲜有研究。本研究通过免疫组化法检测HCC组织GPC3和Shh蛋白的表达，并分析不同病理学特征组织两种蛋白表达的差异，希望为HCC患者的治疗提高新的靶向目标。

1 资料与方法

1.1 病例来源 2013年～2015年在北京大学第三医院接受手术切除治疗的HCC患者96例，男性75例，女性21例；中位年龄为57.5(35，81)岁。根据2019年WHO肿瘤分类标准，进行诊断、组织学分型、分化程度和分期分类。在每一例病例，组织切片包括癌实质和癌旁肝组织。

1.2 组织GPC3和Shh蛋白表达检测 采用免疫组化染色，即EnVision二步法，使用福尔马林固定、石蜡包埋组织切片。应用抗GPC3小鼠单克隆抗体(1:100，GC33，Ventana Medical System，AZ)和抗Shh兔抗人多克隆抗体(1:200，135240，Abcam)和Histofine Envision化学检测试剂盒(DaKo，CA)。应用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。免疫染色评估包括阳性细胞百分比和染色强度。在低倍镜下观察整张切片，选择免疫反应最强的三个代表性区域观察。根据染色强度和阳性细胞百分比，按0～3分分级，即0分，阴性，呈无染色或着色细胞<15%；1分，肿瘤细胞>50%弱染色或15%～50%中度染色；2分，肿瘤细胞>50%中度染色或15%～50%强染色；3分，50%以上的肿瘤细胞呈强染色。将0分和1分归为蛋白低表达组，2分和3分归为高表达组。

1.3 肝癌细胞GPC3和Shh蛋白表达检测 使用四个肝癌细胞系(HepG2、MHCC97H、Huh7和SMMC7721，购自ATCC细胞库)，培养细胞，取细胞爬片和裂解物，分别进行免疫荧光染色和蛋白印迹分析。经过细胞固定，依次加入抗GPC3和二抗AlexaFluors555，抗Shh和二抗AlexaFluors488(Invitrogen)。使用尼康TCSA1共聚焦显微镜采集图像。蛋白印迹分析主要包括蛋白提取、浓度测定、电泳、转膜，加入一抗(同免疫组化)和二抗分别孵育、洗涤后显影。

1.4 蛋白作用分析 应用String数据库(http://string-db.org)预测GPC3和Shh蛋白之间相互作用，检索设定在Multiple proteins界面；在List Of Names输入GPC3和Shh；选择Homo sapiens；生成蛋白质作用网络[11]。

2 结果

2.1 不同病理学特征的HCC患者癌组织GPC3和Shh蛋白表达比较 免疫组化检测结果显示，GPC3和Shh蛋白主要表达于癌细胞胞浆，呈棕色颗粒。少数癌细胞胞膜表达GPC3蛋白(图1)。在96例手术切除的HCC组织中，GPC3和Shh阳性率分别为77.1%和68.8%，其中57例(59.4%)两种蛋白均阳性。GPC3和Shh高表达分别为58例(60.4%)和51例(53.1%)。不同病理学特征患者癌组织两种蛋白表达情况见表1。

图1 不同分化程度HCC患者癌组织GPC3和Shh蛋白表达情况(EnVision二步法，200×)A：高分化HCC患者癌组织和纤维性假包膜(HE)；B：高分化HCC癌细胞胞浆GPC3弥漫性强阳性表达；C：高分化HCC癌细胞胞浆Shh弥漫性强阳性细颗粒状表达；D：低分化HCC患者癌组织(HE)；E：低分化HCC癌细胞胞浆GPC3局灶性强阳性点状表达；F：低分化HCC癌细胞胞浆Shh局灶性弱阳性表达；G：癌旁肝组织微血管瘤栓(HE)；H：癌旁肝组织微血管瘤栓中癌细胞胞浆GPC3强阳性点状表达；I：中分化HCC癌组织(HE)；J：中分化HCC癌细胞胞膜GPC3强阳性表达

表1 不同病理学特征的HCC患者癌组织GPC3和Shh蛋白表达(%)比较

2.2 体外肝癌细胞GPC3和Shh蛋白表达情况 在体外四种癌细胞均可见少数细胞胞浆内GPC3和Shh两种蛋白共表达(图2)；蛋白印迹分析发现在HepG2和MHCC97H细胞，GPC3和Shh表达较弱，而在Huh7和SMMC7721细胞两种蛋白表达相对较强(图3)。

图2 体外肝癌细胞GPC3和Shh蛋白表达(黄色点状)融合图像显示在癌细胞胞浆内少数黄色点状信号(Merge：GPC3、Shh和DAPI 融合生成；GPC3：癌细胞胞浆内红色信号；Shh：癌细胞胞浆内绿色信号；DAPI：细胞核蓝色信号)

2.3 应用数据库预测GPC3和Shh蛋白的作用网络 应用String数据库分析提示GPC3和Shh之间可能存在共同表达(图4)。此外，我们还观察到GPC3与Shh信号通路上的其它蛋白(包括受体Ptch、细胞内信号传导分子Smo和转录因子Gli2)之间也存在数条连线，提示GPC3与Hh通路之间可能也存在相互作用。

图3 体外肝癌细胞GPC3和Shh蛋白表达 (Western blotting) 提示GPC3和Shh蛋白的表达趋势一致

图4 应用数据库预测GPC3和Shh的相互作用(连线) 圆点间连线代表相连两蛋白可能联合参与某项功能，但不表明空间上两蛋白一定相互结合；黑线代表蛋白之间存在共同表达，提示GPC3和Shh之间可能存在共表达

3 讨论

HCC存在高度的肿瘤异质性[12]。2019年WHO消化系统肿瘤分类结合癌的组织结构和细胞异型性，将HCC分化分为高、中、低不同程度。高、中分化的HCC在结构上多以细梁状和假腺样为主，癌细胞异型性小，而低分化HCC多出现粗巨梁、实性团块或肉瘤样结构，癌细胞异型性大[13]。最近的研究通过多组学整合方法，将HCC分为以TP53和CTNNB1突变为代表的多种亚型，证明不同分子事件与分化程度存在紧密联系[14]。本研究观察到在多数高分化HCC癌组织，GPC3和Shh蛋白在癌细胞核周围和靠近细胞膜区密集高表达，而在低分化HCC中，两种蛋白呈局灶性弱表达，仅有少数病例呈高表达。这些结果提示GPC3和Shh蛋白在HCC的组织分化过程中发生了较大的变化，其背后的基因变化及所代表的癌细胞生物学功能还需要进一步研究。

GPC3和Shh信号通路在胚胎的器官和组织发育和细胞成熟过程中起到重要的调控作用。它们一旦被异常激活，往往会导致癌症的发生和进展[15,16]。研究发现在果蝇和小鼠发育过程中，GPC作为多种生长因子和形态形成因子的共受体，结合多种可溶和不溶性配体[17]。通过脂肪酶介导的糖基磷脂酰肌醇锚定的裂解，GPC能够从细胞表面脱落到细胞外空间[18]。所以，GPC不仅能在细胞浆和细胞膜上起作用，在细胞外环境包括循环和远端组织中也起作用。GPC通过改变Wnt、Hh、成纤维细胞生长因子等信号途径，促进细胞增殖和组织生长[7,19,20]。在缺乏GPC核心蛋白或硫酸化糖胺聚糖链的情况下，细胞表面的形态形成因子水平降低，信号传导活性降低。当GPC过表达时，由于额外糖胺聚糖链的结合能力增加，细胞表面的形态形成因子水平升高。Shh是Hh通路的分泌性糖蛋白配体。在果蝇和小鼠模型研究发现，Shh蛋白的分泌、移动和信号传导等一系列过程都受到GPC蛋白的调控[7,21]。在胃癌和横纹肌肉瘤细胞的研究中也发现了GPC和Hh通路的相互作用[16,22]。本研究在体外肝癌细胞观察到GPC3和Shh蛋白的共定位表达，并且两种蛋白的表达趋势一致。此外，经String数据库分析提示GPC3和Shh之间可能存在共同表达，并观察到GPC3也可能与Hh通路受体Ptch、细胞内传导分子Smo和转录因子Gli2存在相互作用。我们推测在HCC发生过程中，GPC可能作为Hh通路的低亲和力共同受体。在分化良好的癌组织，GPC3与Shh结合，可能帮助癌细胞维持Shh-N端分泌性信号，提高Shh的活性和稳定性，保证Shh水平足以激活高亲和力信号受体并确保靶基因的激活，持续促进癌细胞生长和分化。在低分化HCC中，GPC3和Shh蛋白表达较弱，这可能与癌细胞粘附性减弱，或发生上皮-间质转化，或更多的晚期分子事件参与等机制有关，需要通过更深入的实验和分析方法加以揭秘。

HCC微血管侵犯(microvascular invasion，MVI)是指在显微镜下于内皮细胞衬覆的血管腔内见到癌细胞团，以癌旁门静脉分支为主，也包含纤维性假包膜内的血管瘤栓[23]。MVI是评估HCC复发风险和选择治疗方案的重要依据[14,23]。本研究发现在伴有MVI的HCC病例，出现GPC3和Shh蛋白的显著性高表达，在癌旁肝组织中也观察到微血管中悬浮的癌细胞团GPC3蛋白一致性阳性表达。这些结果提示，GPC3与Shh蛋白高表达可能预示HCC患者预后不良，GPC3和Shh可能促进癌细胞的生长和肝内播散，甚而促进癌旁肝组织内的卫星灶的形成。

此外，HCC患者血清GPC3和Shh mRNA和蛋白水平均较高[3,6,24,25]。随着液体活检技术的发展，针对两个分子的联合检测可能对疑似HCC患者的诊断和预后有重要的意义。我们的结果验证了HCC癌组织GPC3和Shh蛋白水平呈高表达，揭示了GPC3可能与Hh信号通路成员存在共表达和相互作用。这些结果为解释HCC发生发展提供了新的机制，针对GPC3和Shh开发诊断和治疗研究具有重要的价值。