新型肌肉高效亲和AAV 血清型的开发

陈 颖， 吴佳梅， 凌菲香， 曾步兵， 郑 静， 吴 侠， 赵 锴， 肖 啸

（华东理工大学药学院，上海 200237）

自1989 年进行首次人类基因转移实验以来，基因治疗（Gene Therapy）发生了翻天覆地的变化，其原理是修复失活或替换导致疾病功能异常的基因，从而重新建立其正常功能[1]。目前用于遗传疾病的大多数体内基因治疗策略主要围绕了两种病毒载体：一是将基因离体转移到造血干细胞和其他干细胞中的慢病毒载体[2]；二是以腺相关病毒（AAV）为载体将基因转移到有丝分裂的细胞中进行治疗[3]。

AAV 最早于1965 年被发现为猿猴15 型腺病毒（Simian adenovirus 15，SV15）制剂中的污染物，该病毒来自被SV15 感染的恒河猴肾细胞培养物[4]。AAV 被归类为细小病毒科的依赖病毒属，由直径约26 nm 的 二 十 面 体 蛋 白 衣 壳 和 约4.7 kb 的 单 链DNA 基因组组成[5]，其结构中包含3 个基因Rep，Cap和AAP参与病毒基因的复制、包装、蛋白衣壳表达等，在病毒生命周期中起着重要作用[6]。

AAV 具有广泛的宿主组织嗜性[7]，可感染分裂细胞和非分裂细胞，且安全性高，这对于全身基因传递是一个优势[8]。目前已经从人和动物组织中分离出了多种AAV 血清型，包括至少12 种自然存在的血清型和100 多种变体，但是尚无与任何已知疾病相关的AAV 血清型[9-10]。各种疾病患者的临床试验中的流行病学分析表明，40%～80%的人群血清抗AAV 抗体呈阳性[11]，这表明人源衣壳作为基因治疗载体可能不是理想的选择，因为机体可能存在针对其衣壳的抗体，从而降低转导效率。非人源衣壳可以避免人类本身存在的免疫反应；同时许多AAV 治疗策略注重细胞或组织特异性表达，故目前许多研究集中于从其他脊椎动物物种中分离出AAV 衣壳，或者对人源AAV 衣壳进行改造，从而减少中和抗体并且实现靶向治疗。

目前已有3 种主要技术来进行AAV 衣壳改造，分别是合理设计、定向改造和计算机辅助设计。改善载体衣壳的首批方法是通过合理设计进行改造，此类策略始于简单嫁接与细胞类型特异性受体结合的肽序列[12]。此方法不仅可以重新定位衣壳，而且还具有阻止免疫学识别的能力。合理设计方法的局限性主要与AAV 细胞表面结合、运输、脱膜和基因表达有关的知识不足有关。因此，从头开始的发现方法即定向进化策略，在许多情况下都是有利的[13-19]。定向进化技术包括易错PCR（Polymerase Chain Reaction）、基因改组、蛋白质片段的靶向重组、合理设计和定向进化结合设计，此方法可以改善或改变生物产品的功能，并已用于开发AAV 载体。最近新颖的衣壳工程的计算机方法已经引起了关注。这种方法是通过计算机设计利用DNA 序列信息和AAV 血清型之间的系统分析来构建潜在的AAV 衣壳库[20-21]，产生具有增强转导的新衣壳变体[22]。

本文通过对AAV 衣壳改造并在肌肉细胞C2C12 中进行筛选以期获得具有高效肌肉亲和性的新型AAV 血清型，实验过程主要通过肽展示的方法在AAV5 的Cap序列573 位氨基酸后随机插入7 个氨基酸片段，筛选得到具有高效肌肉感染能力的AAV5 突变体，并在体内体外对其进行验证。结果表明，本文筛选所得的新型AAV 突变体AAVc1 具有更高的肌肉感染效率，同时中和抗体较低。

1 实验部分

1.1 原料和试剂

AAV5、AAV8、AAV9 3 种血清型腺相关病毒、pAAV-CMV-GFP 质 粒、 辅 助（ pHelper） 质 粒、Ad5（Adenovirus 5，Ad5）质粒为本实验室所有；Primer STAR 高保真酶、T4 连接酶、Benzonase 酶、DNase I酶购自日本TaKaRa 公司；qPCR SYBR Green Master Mix 购自南京诺唯赞生物科技有限公司；各种限制性内切酶、银染试剂盒购自赛默飞世尔科技公司；胶回收 试 剂 盒 购 自Omega Bio-Tek 公 司；NucleoBond Xtra 去内毒素大抽试剂盒购自德国Macherey-Nagel 公司；胎牛血清（FBS）、DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle ’s Medium） 高 糖 培 养 基、 双 抗（Penicillin-Streptomycin，PS）、胰 蛋 白 酶（Trypsin，0.25%）购自美国Gibco 公司；磷酸盐缓冲液（PBS）购自美国HyClone 公司；鸡胚提取物（Chicken Embryo Extract）购自爱必信（上海）生物科技有限公司；GFP tag antibody 购自武汉三鹰生物技术有限公司；曲拉通（Triton X-100）、BSA（Bovine Serum Albumin）、氯化 钠、 碘 克 沙 醇、 Tris-HCl、 蔗 糖 购 自Sigma-Aldrich 公司；OCT（Optimal Cutting Temperature）包埋剂购自德国莱卡公司；多聚甲醛组织固定液购自武汉塞维尔生物科技有限公司；HEK293 细胞、C2C12 细胞购自ATCC 公司；C57BL/6 小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司；猴血清来自重庆眉山猴厂，编号为11559、13061、13073 等。

1.2 实验仪器

台式离心机（FRESCO21 型）、二氧化碳培养箱（BB150 型）购自赛默飞世尔科技公司；超高速离心机（CP70ME 型）购自日本日立公司；PCR 基因扩增仪（Veriti DX 型）购自美国应用生物系统公司；电泳电源（DYY-6D 型）、电泳槽（DYCP-31DN 型）购自北京六一生物科技有限公司；紫外透照台（TL-TM FL-26 型）购 自 美 国Analytik Jena 公 司；凝 胶 成 像 仪（Tanon-2500 型）购自上海天能科技有限公司；多功能酶标仪（Synery H1 型）购自美国伯腾仪器有限公司；恒温金属浴（MK20 型）购自杭州奥盛仪器有限公司；全温落地摇床（ZWY-211C 型）购自上海智城分析仪器制造有限公司； 实时定量基因扩增仪（QTOWER3.0 型）购自德国耶拿分析仪器公司；冰冻切片机（CM1950 型）、荧光倒置显微镜（DMIL 型）购自德国莱卡公司；移液器购自艾本德(中国)有限公司；生化安全柜（BSC-1399IIA2 型）、净化工作台（CA-1390-1 型）购自上海上净净化有限公司。

1.3 实验步骤

1.3.1 肽展示（Peptide display） AAV 肽展示是基于单个血清型骨架，在衣壳表面的暴露位置，引入具有随机序列的寡核苷酸的定向改造AAV 衣壳的方法[23-24]。该方法能产生大量可以用于AAV 进入靶细胞的肽，并鉴定具有增强转导效率的变体。本研究在AAV5Cap基因573 位氨基酸后随机插入7 个寡肽核苷酸，并进行合成，用于后续筛选。

1.3.2 细胞培养、转染、病毒包装、纯化、感染 将HEK293 细胞用含10% (体积分数，下同）FBS、1%（体积分数，下同）双抗的DMEM 高糖培养基中进行培养。将C2C12 成肌细胞用含20% (体积分数，下同）FBS、1%双抗、1%（体积分数，下同）鸡胚提取物的DMEM 高糖培养基中进行培养。为了生产表达GFP的AAV，利用AAV 包装质粒、pHelper 质粒、pAAVCMV-GFP 质粒在聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）条件下进行三质粒转染。48 h 后，收集细胞并通过离心沉淀，将细胞重悬于含150 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）的PBS 溶液中，冷冻融化数次，并在37 °C 下用Benzonase 酶（50 U/mL）处理30 min，通过离心去除细胞碎片，并将上清液加到碘克沙醇梯度溶液（PBS 配制体积分数为10%、20%、40%、50%碘克沙醇溶液）中，在4 °C 下以78000 r/min 的转速离心2 h，然后从40%碘克沙醇相中收获病毒颗粒[25]。将收获的病毒以感染复数为1×105vg/cell 感染C2C12 细胞，观察GFP 绿色荧光表达，每组平行进行5 次实验。

1.3.3 实 时 荧 光 定 量PCR 采 用 实 时 荧 光 定 量PCR 对收集的病毒进行滴度检测，以pAAV-CMVGFP 为标准品，在GFP基因上设计上游引物和下游引物；将5 μL 病毒样品，加入1 μL、5 U/μL DNaseI 酶，并用ddH2O 补充体积至20 μL，于37 °C 水浴锅中消化1 h，然后取出于100 °C 灭活10 min。消化后的样品稀释10 倍并进行荧光定量PCR 反应，反应体系总体积为20 μL，依次加入2×qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL、上游/下游引物各0.5 μL、稀释后的病毒模板1 μL、ddH2O 8 μL。反应程序为95 °C, 预变性5 min；95 °C, 变性10 s；60 °C，退火40 s；变性和退火两个步骤反复40 个循环。溶解曲线为平衡15 s，△T=1 °C，升温速率5 °C/s。根据扩增循环次数Ct（Cycle threshold）值计算包装病毒滴度。

1.3.4 银染 银染是一种用于检测聚丙烯酰胺凝胶中蛋白和核酸的高灵敏度方法，其原理是银离子在碱性条件下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面显色。AAV 的外壳由VP1、VP2、VP3 3 种蛋白按1∶1∶10 数量比组成，利用Thermo Scientific 的银染试剂盒对收集的病毒颗粒进行纯度分析。

1.3.5 动 物 实 验 选 用6～8 周 龄 的SPF（Special Pathogen Free）级 普 通 野 生 型C57BL/6 小 鼠，以3×1011vg/leg 的剂量将AAV9、AAVc1 包装GFP 的病毒肌肉注射小鼠，每组设5 只小鼠。注射病毒3 周后，分别取小鼠胫前肌（Tibial Anterior，TA）、比目鱼肌（Soleus，SO）和腓肠肌（Gastrocnemius，GA）作样品。将样品置于多聚甲醛组织固定液中浸泡24 h，后取出置于0.15 g/mL 蔗糖溶液中进行脱水沉糖，观察肌肉沉入底部，换用0.3 g/mL 蔗糖溶液继续脱水。梯度沉糖后用OCT 包埋剂进行包埋，并进行冰冻切片，切片厚度为25 μm。

1.3.6 免疫荧光染色 对所得的冰冻切片中的GFP目的基因进行免疫荧光染色。首先将样品置于56 °C 烘箱中烤片15 min，取出用PBS 冲洗3 次，每次10 min；用5%（体积分数，下同）BSA，1% （体积分数，下 同）Triton-X100 的PBS 溶 液 封 闭2 h；取GFP 抗体按1∶500 的体积比溶解 在 含5% BSA、0.5% Triton-X100 的PBS 溶液中，滴加至切片上，于4 °C 冰箱孵育过夜。隔天取出切片用0.5% Triton-X100 的PBS 溶液冲洗3 次，每次10 min；将二抗和DAPI（4′,6-diamidino-2-phenylindole）分 别 按1∶500和1∶1000 的体积比溶解于含5% BSA、0.5% Triton-X100 的PBS 溶液中，滴加至切片上，常温孵育2 h后，冲洗3 次，每次10 min；然后滴加防荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片封片，并在荧光倒置显微镜下观察GFP 荧光表达。

1.3.7 中和抗体检测 将AAV9 和AAVc1 分别包装高斯荧光素酶报告基因Gluc，根据中和抗体检测方法进行检测[26]，将细胞Huh7 以每孔1×105个细胞的密度接种到48 孔板中。将血清样品按照2 倍梯度进行稀释，稀释体积比分别为1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32，将1×108个AAV-Gluc 病毒颗粒与血清样品稀释液在4 ℃共同预孵育2 h，将该混合物加入细胞孔板中一起培养。AAV 转导后48 h，使用多功能酶标仪测量细胞裂解物中的荧光素酶活性。与PBS 预孵育的AAV-Gluc 载体转导的细胞相比，血清内中和抗体滴度为将荧光素酶活性降低50%的样品的最高稀释度。

2 实验结果

2.1 新型AAV 血清型的研发

2.1.1 筛 选 高 效 肌 肉 亲 和 性AAV5 突 变 体 利 用Peptide display 技 术 构 建AAV5 嵌 合 文 库 并 从C2C12 细胞中筛选高效肌肉亲和性突变体，结果如图1 所示。在AAV5 的Cap基因N573 后随机插入7 个氨基酸寡肽片段，经合理设计并合成AAV5 随机质粒文库，将构建的病毒包装质粒与pHelper 质粒共转染至HEK293 细胞形成感染性的嵌合AAV5文库。

图1 从C2C12 成肌细胞中筛选AAV5 突变衣壳Fig. 1 Screen of AAV5 mutant capsids from C2C12 myoblast cell

肌肉细胞对野生型AAV5 的转导敏感性很低，为了筛选得到高效感染肌肉细胞的AAV5 突变体，将AAV5 嵌合文库与Ad5 质粒(感染复数为25 pfu/cell)共感染小鼠C2C12 成肌细胞，48 h 后收取细胞裂解液，用于下一轮的感染，如此反复感染C2C12 细胞4～5 次，将每个感染周期收集的病毒提取病毒DNA，并对Cap基因随机插入区域进行测序，分析出现频次最高的突变体，说明该突变体在细胞C2C12 中有较高的转导效率，如此得到插入寡肽片段为PGPSPAD 的突变体，以下均称为AAVc1,将其作为候选新型AAV 血清型用于后续分析。

2.1.2 不同AAV 血清型效价分析 对AAVc1 以及几种不同野生型AAV 血清型包装效率进行荧光定量PCR 和银染分析，结果如表1 所示。将所得新型突变体AAVc1 包装质粒、辅助质粒（pHelper）、表达目 的 基 因GFP的 质 粒（ pAAV-CMV-GFP） 按 照1∶2∶1 的质量比共转染HEK293 细胞，72 h 后收集细胞上清以及细胞，经反复冻融以及纯化后收集病毒。选取几种野生型AAV 血清型AAV5、AAV8、AAV9 重复上述操作，如此获得不同血清型包装GFP 的病毒。对4 种病毒进行qPCR 定量分析得到病毒滴度值，同时利用银染定量AAV 总蛋白量，二者比值为包装病毒的实心率即实心与总蛋白的比例。通过计算得到AAV5、AAV8、AAV9 和AAVc1的实心率分别为66.06%，47.38%，38.74%和66.32%。这说明AAVc1 与AAV5 的实心率相差不大，但相对于AAV8，AAV9 则有更高的包装效率，说明筛选所得AAVc1 具有较高且稳定的病毒包装效率。

表1 AAV 血清型效价的定量Table 1 Quantification of AAV serotype titer

2.2 不同AAV 血清型感染C2C12 成肌细胞

为了探究AAVc1 包装GFP报告基因感染C2C12 细胞的转染效率，将上述4 种血清型包装GFP的病毒以感染复数1×105vg/cell 感染C2C12 细胞，于72 h 后观察绿色荧光表达，表达情况如图2（a）所示。可以看出相对于几种野生型的AAV 血清型，AAVc1 有更强的荧光表达。同时对感染C2C12 细胞中呈现GFP 阳性的细胞进行了定量分析如图2（b）所示，对其中的GFP 阳性细胞以及总细胞进行计数，可见AAVc1 阳性细胞数显著高于其他3 种野生型AAV。已知AAV5 感染肌肉效率低，而AAV8、AAV9对全身器官和组织有普遍的感染效率，相比较之下，新筛选得到的AAVc1 显示了强大的肌肉细胞感染效率。

图2 AAV 在C2C12 成肌细胞中的转导效率Fig. 2 Transduction efficiency of AAV in C2C12 myoblast cell

2.3 AAV9-GFP 和AAVc1-GFP 肌肉注射小鼠

为了进一步验证AAVc1 强大的肌肉转导效率，用AAVc1-GFP（AAVc1 包装质粒GFP 获得的病毒）和AAV9-GFP（AAV9 包装质粒GFP 获得的病毒）以3×1011vg/leg 的剂量肌肉注射WT 小鼠，观察其在体内的感染效率，结果如图3 所示。在病毒注射小鼠3 周后进行解剖取小鼠腿部肌肉，分别取小鼠胫前肌、比目鱼肌和腓肠肌进行冰冻切片以及GFP 的免疫荧光染色。因骨骼肌纤维主要分慢肌纤维（I 型）和快肌纤维（II 型），I 型肌纤维收缩慢，靠线粒体氧化磷酸化供能；II 型肌纤维收缩快，主要以糖酵解反应供能。而胫前肌以II 型肌纤维为主，比目鱼肌以I 型肌纤维为主，腓肠肌则是混合肌含两种肌纤维[27]，故可观察GFP 在不同类型肌肉中的表达。由图3（a）可以观察到小鼠3 种腿部肌肉中的绿色荧光表达，AAVc1 显著高于AAV9；本文量化了转导效率，对免疫荧光图中的GFP 阳性细胞以及总细胞计数，将GFP 阳性肌肉细胞数的比例以及荧光强度进行了对比，结果如图3（b）、3（c）所示，AAVc1 和AAV9 在感染小鼠肌肉上有着显著性差异。同时AAVc1 对不同的肌肉类型均有较强的转导效率，进一步说明了其强大的肌肉转导效率。

图3 AAV 在小鼠肌肉中的转导效率Fig. 3 Transduction efficiency of AAV in mouse muscle

2.4 猴子血清中和抗体检测

将AAV9 和AAVc1 分别包装高斯荧光素酶报告基因Gluc用于中和抗体检测，检测10 只猴子血清中对这两种血清型的中和抗体滴度，结果如表2 所示。定义猴血清的稀释比为中和抗体滴度，使用多功能酶标仪检测高斯荧光素酶活性并计算得到中和抗体滴度值，滴度值大于1∶4 为中和抗体阳性，小于或等于1∶4 为阴性，可以看出AAVc1 的中和抗体滴度相对于AAV9 整体偏小，部分猴子对AAV9 显示有较高的中和抗体，而对AAVc1 的中和抗体滴度很低。这说明相对于AAV9，新型AAV 血清型AAVc1有较低的中和抗体滴度。应用到临床中时，体内有较高AAV9 中和抗体的患者可以选用AAVc1 这一血清型进行治疗，从而扩大了临床使用AAV 治疗疾病的选择。

表2 猴子血清中不同AAV 血清型的中和抗体检测Table 2 Detection of neutralizing antibodies of different AAV serotypes in monkey serum

3 讨 论

目前AAV 在基因治疗中显示出巨大的潜力，但依旧面临诸多的挑战，如AAV 衣壳的免疫反应、无效的病毒生产和纯化方法、缺少组织器官特异性以及缺乏评估人类临床试验中AAV 转导效率的可靠系统。AAV 载体的遗传修饰可以克服其在临床应用的一些障碍，对AAV 衣壳进行修饰能够增强转基因表达并且阻止对AAV 衣壳和转基因的免疫反应。本研究旨在获得具有高效肌肉亲和性新型AAV 血清型，主要采用肽展示的技术在AAV5cap基因中随机插入7 个氨基酸寡肽，在C2C12 细胞中经过几轮筛选得到最频繁的突变体AAVc1，其插入的7 个氨基酸为PGPSPAD。筛选得到新型AAV 血清型AAVc1，在体内外评价结果均表明AAVc1 具有稳定的肌肉亲和力，相对于野生型AAV 血清型大大提高了转导效率，且有较低的中和抗体，从而成功改造得到了具有高效肌肉感染力的AAV 血清型。

据报道研究表明AAV5 对眼睛、肺、神经系统有很好的转导效率[1]；AAV8 则显示出能有效将基因转导至肝脏中[28]、在肌肉中也有较好的转导效率；而AAV9 在全身组织和器官中有普遍的表达，因其能够穿过血脑屏障[29-30]，在中枢神经系统疾病上有广泛的应用；AAV8 和AAV9 虽有较好的肌肉亲和力，但缺乏特异性。本研究筛选得到的AAVc1 相对AAV8、AAV9 具有更好的肌肉亲和性，实验研究虽使用小鼠肌肉细胞系进行筛选，对人源肌肉细胞和组织的相关应用也有一定借鉴意义。从生理角度分析，肌肉组织的生长发育过程以及接受运动神经电信号产生肌肉收缩偶联并完成运动功能的过程在哺乳动物中都是相对保守的，人和鼠的肌肉在组织结构和生理功能上是高度相近的[31-32]；从分子生物的角度分析，大约99%的小鼠基因在人类基因组中具有同源物，96%的同源物位于人类基因组中类似的保守同线区间内。小鼠和人类基因组之间的保守程度允许对鼠类生物学的研究在很大程度上表征了人类的生物学特性[33]。例如下面几种肌肉代表性基因，根据数据库检测小鼠的这些基因与人源基因有较高的同源性，其 中LMNA（ Lamin A/C） 96.4%、 SYNE1（ Spectrin repeat containing nuclear envelope protein 1）84.8%、FHL1（Four and a half LIM domains 1）94.3%、TMEM43（Transmembrane protein 43）93.0%、SUN2（Sad1 and UNC84 domain containing 2） 81.4%、 TTN（ Titin）89.6%。本研究中使用小鼠成肌细胞C2C12 表明AAVc1 具有感染肌肉的高效性，根据小鼠肌肉细胞与人源细胞的相近程度可以推断出AAVc1 在人源细胞中会有较高的感染效率。

当AAV 进入人或其他动物宿主后，宿主血液中的中和抗体会与AAV 衣壳蛋白结合，阻断了病毒和细胞表面受体结合并进入细胞的过程，使病毒失活，同时被抗体结合标记上的病毒颗粒也会被宿主免疫系统更快清除[1]。多数研究对各种AAV 的中和抗体在不同民族、地域和年龄人群中的分布进行了统计，发现AAV5 中和抗体在各人群中的分布比率(10%～30%)低于其他AAV 血清型, 如AAV2 (30%～80%)，AAV8 或AAV9 (20%～60%)[11,34-35]。此外进一步的流行病学研究也表明相对于AAV1、AAV2、AAV6、AAV8、AAV9 等血清型，AAV5 具有更低的免疫反应[35-36]。故本研究以中和抗体分布较低的AAV5 作为模板，在衣壳蛋白的可变区插入新的寡肽段，将进一步改变衣壳蛋白表面的氨基酸序列乃至高级结构，使得本来可以识别并结合到衣壳蛋白的中和抗体无法结合至改造后的AAV 衣壳蛋白上，从而进一步降低中和抗体分布比率。

综上所述，本研究筛选得到的具有高肌肉感染能力的AAVc1 为基因治疗提供了新的AAV 血清型，可用于治疗肌肉相关疾病，也可作为疫苗研发的载体，为之后的临床实验提供了新的选择，也扩大了基因治疗的适用人群。