脓毒症大鼠心房肌细胞部分心电改变及其对心房颤动易感性的影响*

吕永 樊哲儒 罗俊苗 王晞 王龙

脓毒症患者易并发心房颤动（简称房颤）[1—2]，房颤是脓毒症和脓毒症休克患者死亡的一个独立危险因素，新发房颤与脓毒症患者重症监护病房的住院时间增加有关，而阵发性房颤的发展与死亡率增加明显相关[3]。脓毒症时促炎细胞因子的系统性释放、高循环应激激素水平、自主神经功能障碍、器官功能障碍都会导致心房的电重构和结构重构，诱发房颤[4]。然而，与脓毒症房颤相关的心电改变研究较少，对其发生机制仍不清楚，笔者以脓毒症大鼠作为研究对象，探究脓毒症大鼠心房肌钠通道（INa）和超快速延迟整流钾通道（Ikur）的变化，以及对脓毒症大鼠房颤易感性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 清洁级雄性SD 大鼠40只，七周龄，体重（220±50）g，购自武汉大学人民医院实验动物中心。随机分为两组:假手术组（n＝20），脓毒症组（n＝20）。适应性饲养一周后，禁食8 h，采用腹腔注射脂多糖（10 mg/kg）的方法建立脓毒症大鼠模型，以脓毒症组大鼠呼吸频率加快，被毛蓬松竖立，眼周出现血性分泌物，大便呈稀水样视为造模成功[5]。假手术组腹腔注射相同剂量的生理盐水，两组均于术后48 h进行后续实验。

1.2 实验试剂与溶液 脂多糖（Lipopolysaccharide），牛血清白蛋白（BSA），胶原酶Ⅱ（CollagenaseⅡ），乙二醇-双四乙酸（EGTA），N-2-羧基派哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES），牛磺酸（Taurine）及L-谷氨酸（L-Glutamic acid）均来自于美国Sigma公司，其他试剂均来自于国产分析纯。

无钙台式液（mmol/L）:NaCl 135、KCl 5.4、MgCl21.0、Na H2PO40.33、HEPES 10、Glucose·H2O 10，PH 用NaOH 调至7.40。KB 液（mmol/L）:KCl 40、KH2PO420、L-glutamate 50、Taurine 20、EGTA 0.5、HEPES 10、Glucose·H2O 10、KOH 70、MgCl23，PH 用KOH 调至7.35。酶液:无钙台式液60 ml+0.12 g BSA+0.03 gⅡ型胶原酶+100 ul 50 mmol/L CaCl2。记录INa的细胞外液（mmol/L）:NaCl 135、CsCl 5.4、MgCl21.0、CaCl21.8、Glucose·H2O 10、CdCl20.1，PH 用NaOH 调至7.35～7.40。记录INa的细胞内液（mmol/L）:CsCl 133、NaCl 5.0、TEA-Cl 20、EGTA 10、HEPES 5.0、Mg ATP 5.0，PH 用Cs OH 调至7.35。记录Ikur的细胞外液（mmol/L）:NaCl 136、KCl 5.4、MgCl21.0、Na H2PO40.33、HEPES 10、CaCl22.0、Glucose·H2O 10、Cd Cl20.3、BaCl20.5，PH 用NaOH 调至7.40。记录Ikur的细胞内液（mmol/L）:KCl 140、MgCl21.0、HEPES 10、EGTA 5.0、Na2ATP 5.0，PH 用KOH 调至7.20。

1.3 心电指标及房颤易感性检测 大鼠称重后，腹腔注射3%戊巴比妥（60 mg/Kg），大鼠完全麻醉后固定在实验台上，进行气管插管并连接呼吸机正压通气，电极一端连接生物电放大器（澳大利亚ADInstruments公司），一端放置在大鼠四肢皮肤下采用Labchart软件记录心电图及分析心率及P 波持续时间，开胸暴露心脏后刺激电极和记录电极分别安置在左心房表面，采用连续6个Burst刺激（5 V，50 Hz，2 s）进行房颤的诱发，Labchart软件进行记录和分析。房颤诱发率为Burst刺激诱发出房颤的动物数除以每组动物总数；房颤诱发成功定义为连续6个Burst刺激中有1个Burst刺激使心房产生持续1 s以上的不规则电活动，肢体心电图显示P 波消失，大小不同、间隔不等、形式不同的f波代替P波。

1.4 大鼠心房肌细胞的分离 大鼠称重后，腹腔注射肝素500 UI/Kg，10 min后腹腔注射3%戊巴比妥（60 mg/Kg），大鼠完全麻醉后开胸，于心脏根部保留主动脉1～2 cm 剪下心脏，立即放入预冷的4℃无钙台式液中洗净血液，1 min内插入主动脉套管，固定在用无钙台式液预冲洗的Langendorff灌流装置（澳大利亚ADInstruments公司）上，用无钙台氏液经主动脉逆行灌流，依次结扎肺动脉干，肺静脉，主动脉分支，使心房完全充盈。整个灌流过程中全程通氧，灌流温度控制在36.5～37.5℃，灌流速度9～10 ml/min。无钙台式液灌流5 min后采用酶液灌流，消化至心房半透明，明显蓬松变软时停止消化，剪下心房，于20 ml KB液中剪成1 mm3大小细胞碎块，通氧孵育10 min，静置分杯。后吸弃上清液，再次剪碎细胞组织块加KB 液至20 ml，经200目尼龙网过滤后得细胞悬液，梯度复钙至1.2 mmol/L，室温下静置2 h进行后续膜片钳实验。

1.5 全细胞膜片钳实验 细胞外液充氧冲洗细胞池后，将细胞悬液加入细胞池内，待细胞贴壁后选择梭型，纹理清晰的心房肌细胞进行实验。采用P97型玻璃微电极拉制仪（美国Sutter公司）拉制玻璃微电极，使玻璃微电极灌注电极内液后入液电阻5～7 MΩ，利用三维操纵器缓慢移动电极，使电极与细胞表面形成高阻封接后破膜，给予漏电流和快慢电容补偿，形成全细胞记录。电流信号经Ag/AgCl引导，由膜片钳放大器（德国HEKA 公司）放大，Pulse软件（Version 8.63，Heka）记录，所有数据储存在计算机中用于后续分析。

1.6 电流记录程序及曲线拟合方法[6—8]INa激活刺激程序:—120 m V 钳制电压，200 ms时程，阶跃为5 m V，刺激间隔为1 s，从—100 m V 到+55 m V的去极化电压脉冲刺激引出INa。INa失活曲线刺激程序:将细胞钳制在—140 m V，先给予200 ms时程，—140 ～—30 m V 的电压脉冲刺激（阶跃为10 m V，刺激间隔为6 s），随后记录—35 m V（50 ms）电压下的INa。INa失活后恢复刺激程序:将细胞钳制在—120 m V，给予两个50 ms时程，—30 m V 的去极化刺激P1和P2（时间间隔为10 ～1200 ms），然后恢复至钳制电压。Ikur激活刺激程序:将电位钳制在—50 m V，给予100 ms，+40 m V 的预刺激脉冲，失活瞬间外向钾电流（Ito）。间隔10 ms，再次将电位钳制在—50 m V，给予300 ms、阶跃10 m V、—40～+60 m V 的系列去极化脉冲记录Ikur。

INa激活和失活曲线拟合:按照电流/电流最大值（I/Imax）＝1—1/{1+exp[（Vx—V1/2）/k]}进行拟合，其中Vx为不同的去极化脉冲电压，V1/2为通道激活或失活50%时的脉冲电压，k为斜率因子。

INa失活后恢复曲线拟合:采用I/Imax＝1—exp（-t/τ）进行拟合，式中，t为恢复时间，τ为通道恢复的时间常数。

Ikur激活曲线拟合:按照电流/电流最大值（I/Imax）＝1-1/{1+exp[（Vx-V1/2）/k]}进行拟合，其中Vx为不同的去极化脉冲电压，V1/2为通道激活50%时的脉冲电压，k为斜率因子。

1.7 统计学分析 采用GraphPad Prism 8进行统计学分析，Origin 2019b进行绘图，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验。计数资料用率表示，采用卡方检验。以P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 两组一般情况 造模后48 h，假手术组无死亡，精神良好，总体状况无明显变化，但在进行气管插管操作时2只大鼠出现意外死亡；脓毒症组精神萎靡，进食减少，被毛蓬松竖立，眼周出现血性分泌物，大便呈稀水样，48 h后死亡2只。

2.2 两组心电指标及房颤易感性比较 与假手术组相比，脓毒症组心率加快[（405.07±9.95）次/分vs（370.13±11.12）次/分，P＜0.05]；P 波时限（PWD）显著延长[（17.03±0.35）ms vs（14.04±0.46）ms，P＜0.05]，脓毒症组房颤的诱发率更高[（66.7%（12/18）vs 33.3%（6/18），P＜0.05]，两组Burst刺激后典型肢体导联和心房外膜心电图见图1。

图1 两组大鼠Burst刺激后肢体导联与心房外膜心电图典型表现

2.3 两组心房肌细胞INa的比较 与假手术组比较，脓毒症组心房肌细胞INa电流密度明显降低（在—60 m V 时达到峰值，[（—219.76±13.24）p A/p F（n＝6）vs（—74.56±9.49）p A/p F（n＝6），P＜0.01]（见图2C）。

与假手术组相比，脓毒症组INa的激活动力学无差异[（V1/2为（—70.52±0.08）m V（n＝6）vs（—56.22±8.85）m V（n＝6），k1/2为[（1.71±0.10）n＝6]vs（1.26±0.32）（n＝6），P均＞0.05]（见图2D）]。与假手术组比较，脓毒症组的失活曲线右移，半失活电压V1/2从[（—99.88±13.24）m V（n＝6）移动到（—74.56±9.49）m V（n＝6），P＜0.01]，k1/2无显著差异[（7.81±0.39）（n＝6）vs（7.57±0.65）（n＝6），P＞0.05]（见图2E）。

与假手术组比较，脓毒症组的INa失活后恢复曲线左移，通道恢复时间从[（16.09±0.97）ms，n＝6]减小到[（9.28±0.82）ms，n＝6]，具有统计学差异（P＜0.01）（见图2F）。

图2 两组心房肌细胞INa的比较

2.4 两组心房肌细胞Ikur的比较 两组大鼠心房肌细胞Ikur电流密度无显著差异（在+60 m V 时达到峰值，[（5.38±0.53）m V，n＝6 vs（4.80±0.63）m V，n＝6，P＞0.05]（见图3C）。与假手术组比较，脓毒症组Ikur激活曲线左移，半数激活电压V1/2降低[（31.86±1.01）m V，n＝6 vs（47.06±3.67）m V，n＝6]（P＜0.01），k1/2无显著差异[（26.16±2.00），n＝6 vs（22.63±1.18），n＝6]（P＞0.05）（见图3C）。

图3 两组心房肌细胞Ikur的比较

3 讨论

脓毒症可对心脏功能及心电生理造成明显的影响，目前研究脓毒症心脏损伤常采用盲肠结扎模型和毒血症模型，但盲肠结扎模型易形成局部脓肿，且实验过程中人为因素可导致脓毒症严重程度的变化，不易控制。而脂多糖作为革兰阴性杆菌重要的致病物质，可以有效的激活心肌细胞炎症通路造成心脏损伤，且通过腹腔注射脂多糖操作简单，重复性、可控性强，模型标准化程度高[9]，因此笔者采用腹腔注射脂多糖的方式来构建脓毒症心脏损伤模型。

既往的研究多集中于脓毒症后心室功能的改变，缺乏对脓毒症后心房心电生理改变的研究[10—12]。而心房心电改变在心房颤动的发生和维持中发挥着至关重要的作用，房颤发生时主要表现为心房有效不应期的缩短和传导速度的下降，跨膜离子流的改变是这其中最重要的决定因素。多种机制参与了房颤的发生，普遍认可的折返学说认为房颤的发生与持续与折返环的数量密切相关，而折返环的数量又与波长（传导速度×有效不应期）呈负相关[13]。心房肌细胞INa是动作电位启动和传播的基础，也是决定传导速度的关键因素，在动作电位的0期，钠离子通道快速打开产生内向的钠去极化电流（INa），INa的下降会使传导速度明显减慢，进而导致折返环数量的增加，从而导致房颤的发生和持续[13—14]。笔者通过研究脓毒症后心房肌细胞离子通道改变，发现脓毒症对大鼠钠通道激活无明显影响，但脓毒症大鼠心房肌细胞INa电流密度明显低于假手术组，半失活电压增大，通道关闭后再次恢复开放时间减小，这提示脓毒症大鼠可能通过降低INa电流密度，减少离子内流，减慢失活，缩短钠通道恢复时间，减慢传导速度，进而增加折返环的数量来参与房颤的发生和维持。

Ikur只在心房表达，具有快速激活动力学，很少或没有失活，在动作电位的早期复极化发挥重要作用[15]。因Ikur电流的心房特异性，其被认为是一个具有抗房颤优势的心房选择性药物靶点[16]。有研究表明，Ikur电流的持续激活可能使心肌细胞适应性的减少Ikur电流密度，易于早期后除极，增加心房对应激诱导的触发活动的易感性，增加心房复极离散度，促进各向异性传导，引发并维持房颤[17]。本研究结果表明，脓毒症大鼠Ikur电流密度与假手术组相比无明显差别，但半数激活电压显著降低，提示脓毒症可能通过促进Ikur电流的激活进而增加房颤的易感性，为脓毒症后房颤的治疗提供了新的方向。

综上所述，本研究发现脓毒症大鼠房颤易感性明显增加，心房钠离子电流密度明显降低，半数失活电压增大，超快速延迟激活钾电流半数激活电压降低，这些心房肌离子通道电流的改变可能通过减慢传导速度，增加折返环的数量等参与了脓毒症大鼠房颤的发生和维持。此外内毒素释放、炎症、自主神经功能障碍、电解质紊乱、机械通气、药物的使用和心功能障碍都可能导致脓毒症后房颤的发生[18—19]，但具体的机制仍有待进一步的研究，明确其中的相关机制将为脓毒症房颤患者的预防和治疗提供新的理论依据。