紫锥菊中菊苣酸的萃取工艺研究

高莹慧 岳鑫滢 周扬 张瑶 迟羽淳 扬敏 张天锡 李峰

摘要：目的 提高乙酸乙酯对菊苣酸的萃取效率，优化一套经济高效适于工业放大生产的萃取工艺。方法 以菊苣酸的萃取率和纯度为评价指标，通过单因素实验考察药液浓度、药液pH值、萃取次数、萃取剂用量、萃取时间、萃取搅拌时间、萃取搅拌转速对萃取工艺的影响。结果 最佳萃取条件为药液菊苣酸浓度为15 mg·mL-1，药液pH=2，乙酸乙酯用量与药液体积分数比例为1∶1，萃取2次，每次萃取时间为40 min（搅拌15 min、静置25 min），搅拌转速为100 r·min-1。在此条件下，菊苣酸纯度为41.4 %，纯度提高了13.0 %，萃取率为98.4 %。结论 该工艺稳定可靠，操作简便，适用于工业生产，可为紫锥菊中菊苣酸的工业萃取提供参考。

关键词：紫锥菊;菊苣酸;萃取率;纯度;单因素

中图分类号：R284.2   文献标志码：A   文章编号：1007-2349（2022）02-0075-06

紫锥菊（Echinacea pupurea（L.）Moench）為菊科紫锥菊属多年生草本植物[1]，主要含咖啡酸衍生物、多糖和糖蛋白及烷酰胺类化合物等[2]。菊苣酸作为咖啡酸衍生物中重要的、具代表性的化合物[3-4]，广泛应用于药品、营养补充剂和保健食品。本课题组前期研究发现紫锥菊提取物菊苣酸抗RSV疗效显著，在抗RSV新型候选药物的开发中具有广阔的前景。为菊苣酸抗RSV制剂生产提供高纯度的原料来源，本实验以紫锥菊醇提物为原料，以菊苣酸的纯度及萃取率为指标，探究菊苣酸的乙酸乙酯萃取工艺，旨在优化出一套环保经济、简便高效适用于工业化的萃取工艺方案。

1 材料与仪器

1.1 药材 紫锥菊购自青州市康达中药材种植专业合作社（批号：20190630），经山东中医药大学药学院李峰教授鉴定为菊科植物紫锥菊属紫锥菊（Echinacea pupurea（L.）Moench）的干燥地上部分。菊苣酸标准品（中国食品药品检定研究所，批号：111752-201703，纯度≥97.60 %），乙酸乙酯（天津市富宇精细化工有限公司、批号：20190815、分析纯）等。

1.2 仪器 Agilent 1260 Infinity型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司），CPA 2250型电子分析天平（十万分之一，德国赛多利斯公司），pHS-3C型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司），CSU-20型顶置搅拌器（上海小聪科技有限公司），SY-2000型旋蒸仪（上海亚荣生化仪器厂），TDL-5-A型低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），DZF型真空干燥箱（北京市永光明医疗器械有限公司）。

2 实验方法

2.1 菊苣酸的检测方法

2.1.1 高效液相色谱条件 ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相0.2 %磷酸水（A）-乙腈（B），体积流量1.5 mL·min-1;检测波长330 nm;柱温35 ℃;进样量5 μL，梯度洗脱条件见表1。

2.1.2 菊苣酸标准曲线的绘制 按照2.1.1的色谱条件，分别取浓度为120、210、300 、360、480 μg·mL-1对照液，分别测定峰面积。以对照品浓度X（μg·mL-1）为横坐标，峰面积Y（mAU）为纵坐标，得回归方程：Y=18.475X-626.932，r=0.9997，线性范围：120～300 μg·mL-1。菊苣酸对照品标准工作曲线如图1所示。

2.2 供试液的制备 称取紫锥菊药材500 g于10 L圆底烧瓶中，以30 %乙醇提取液经旋蒸浓缩水沉处理使药液浓度为3 mg·mL-1，调pH=3上层析柱。收集30 %乙醇洗脱液，在50 ℃，70 r·min-1条件下旋蒸浓缩至无醇味，配置成浓度为15 mg·mL-1，pH=2的供试液。

2.3 萃取工艺单因素实验

2.3.1 萃取浓度考察 取供试液配置成浓度分别为45、35、25、15、5 mg·mL-1的药液，分别用等体积乙酸乙酯萃取2次，每次10 min，水相旋蒸浓缩（T=60 ℃，v=70 r·min-1）至无乙酸乙酯味，取样经HPLC检测萃取率，有机相旋蒸浓缩（T=40 ℃，v=70 r·min-1）后水浴（T=60 ℃）挥去溶剂真空干燥（T=60 ℃，P=0.08 MPa），取样经HPLC检测纯度。

2.3.2 萃取pH考察 取供试液调pH分别为2、3、4、5，量取4份30 mL乙酸乙酯置于分液漏斗内，分别取等体积不同pH药液进行萃取2次，萃后水相调至相应pH，进行第二次萃取，每次萃取10 min。

2.3.3 萃取比例考察 将乙酸乙酯用量与药液体积分数按1∶2、1∶1、2∶1、3∶1的比例分配，分别量取15、30、60、90 mL乙酸乙酯置于分液漏斗中，再均加入30 mL的供试液，萃取2次，萃后水相调至相应pH，每次萃取10 min。

2.3.4 萃取次数考察 量取30 mL乙酸乙酯及同等体积的供试液于烧杯内，将萃取次数分为1、2、3进行萃取。每次萃取完成后用6 mol·L-1 NaOH溶液调到pH=2，每次萃取10 min。

2.3.5 萃取时间考察 量取30 mL乙酸乙酯及同等体积的供试液于烧杯内，分别萃取10 min、20 min、30 min、40 min、60 min，考虑萃取次数对萃取时间有影响，每个条件分别萃取2次和萃取3次。萃后水相调至相应pH，再按照相应时间和次数进行萃取。

2.3.6 萃取搅拌时间考察 考虑工业生产实际情况，故对搅拌时间、搅拌转速进一步考察。量取30 mL乙酸乙酯及同等体积的供试液于烧杯内，以100 r·min-1的搅拌转速分别搅拌5、10、15、20 min，转移至分液漏斗内分别静置35、30、25、20 min，萃取水相调pH=2，同样条件进行第2次萃取。

2.3.7 萃取搅拌转速考察 量取30 mL乙酸乙酯及同等体积的供试液于烧杯中，分别以50、100、150、200 r·min-1转速搅拌15 min，然后转移至分液漏斗内静置25min，萃取水相调pH=2，同样条件进行第2次萃取。

3 结果

3.1 萃取浓度考察结果 测定不同药液浓度对菊苣酸萃取率和纯度的影响，结果见图2

在萃取过程中，随萃取原液浓度的减小，上层有机相颜色从红棕色过渡到黄棕色，下层水相颜色由深红棕色过渡到浅红棕色。若萃取浓度太低需要消耗的有机溶剂增加，经济成本较高;若浓度过高，在浓缩过程中会造成菊苣酸的损失。当药液浓度为15 mg·mL-1时菊苣酸萃取率及纯度均较高，故选择药液浓缩浓度为15 mg·mL-1。

3.2 萃取pH考察结果 测定不同药液pH对菊苣酸萃取率和纯度的影响，结果见图3。

pH=2、3时有机相红棕色;pH=4、pH=5时有机相为澄清的黄绿色。当pH=2时，菊苣酸主要以分子形式存在，在酸水中的溶解度降低，在乙酸乙酯中溶解度较大，萃取率和纯度较高。当pH=4、5时大部分菊苣酸保留在水相，所以菊苣酸的萃取率和纯度均较低。根据实验数据，当药液为pH=2时菊苣酸萃取率及纯度均较高，故选择药液pH=2。

3.3 萃取比例考察结果 测定乙酸乙酯用量与药液体积分数不同比例对菊苣酸萃取率和纯度的影响，结果见图4。

随着乙酸乙酯比例的增加，上层有机相萃取颜色由浅黄棕色变为红棕色乙酸乙酯用量与药液体积分数比例为1：1时萃取率较高，纯度最高;乙酸乙酯用量与药液体积分数比例为3∶1时，萃取率最高。综合考虑在工业生产成本问题，选择乙酸乙酯用量与药液体积分数比例为1∶1为最优萃取条件。

3.4 萃取次数考察结果 测定萃取次数不同对菊苣酸萃取率和纯度的影响，结果见图5。

第1次萃取时，上层有机相呈澄清红棕色，色浅于药液，下层水相红棕色;第2次萃取时，上层有机相橙黄色，下层水相颜色变淡，为浅红棕色;第2次萃取时，上层有机相颜色变为澄清的浅黄绿色，下层水相颜色较第二次萃取变浅。当萃取次数较少时，有效成分不能完全萃出，萃取不完全，导致萃取率较低，纯度较低，当萃取次数为3次时，萃取率及纯度均较高。

3.5 萃取时间考察结果 测定不同萃取时间对菊苣酸萃取率和纯度的影响，结果见图6～图8。

当萃取次数为2次时，上层有机相颜色呈浅红棕色;萃取次数为3次时，上层有机相颜色呈黄绿色;萃取2次时菊苣酸基本被完全萃出。当萃取时间过短时，有效成分不能完全萃出，萃取不完全，延长萃取时间有利于提高有效成分的萃取率和纯度;根据实验比较发现，当萃取次数定为2次时，通过延长萃取时间，可以提高萃取效果，综合考虑，故选择萃2次，每次40 min。

3.6 萃取搅拌时间考察结果 测定不同搅拌时间对菊苣酸萃取率和纯度的影响，结果见图9。

随着萃取搅拌时间的增加，上层有机相颜色为澄清的浅红棕色，当搅拌时间少于15 min时，菊苣酸和乙酸乙酯接触不完全，进入乙酸乙酯中的量较少，导致萃取率较低;若搅拌时间过长，会出现乳化现象。当搅拌时间为15 min，萃取时间为25 min时，萃取率及纯度最高。

3.7 萃取搅拌转速考察结果 测定不同搅拌转速对菊苣酸萃取率和纯度的影响，结果见图10。

随着萃取搅拌转速的增加，上层有机相颜色由黄棕色过渡到红棕色，若萃取转速较慢，菊苣酸和乙酸乙酯未能良好接触，使萃取率较低;转速过快，乳化现象严重。根据实验数据，当搅拌转速为100 r·min-1时，菊苣酸萃取率及纯度均较高，故选择搅拌转速为100 r·min-1。

4 验证实验

4.1 萃取验证1 不考虑搅拌时间及搅拌转速的影响，进行萃取验证1。量取30 mL乙酸乙酯及同等体积pH=2、浓度为15 mg·mL-1的供试液于分液漏斗混匀后静置，共萃取2次，每一次萃取40 min。第1次萃后水相调pH=2，进行第2次萃取，水相、有机相处理后检测分析，萃取结果见表2、图11。

根据以上最优条件，重复进行3次平行实验，得到菊苣酸的萃取率99.3 %，纯度0为40.3 %。

图11 菊苣酸萃取验证1色谱图

4.2 萃取验证2 考虑搅拌时间及搅拌转速的影响，进行萃取验证2。取pH=2、浓度为15 mg·mL-1供试液30 mL与同体积乙酸乙酯于烧杯内以100 r·min-1转速搅拌15 min，转至分液漏斗内静置25 min，第1次萃取水相调pH=2，同样方法进行第2次萃取，水相、有机相处理后检测分析，萃取结果见表3、图12。

重复进行3次平行实验，萃取验证2菊苣酸的萃取率为98.4 %，纯度为41.4 %。

5 讨论

通过对比萃取验证1和萃取验证2可以发现：在实验室小试条件下，增加搅拌条件对萃取率影响不大，菊苣酸纯度略有增加;说明搅拌不会造成菊苣酸的损失，在工业生产中采用搅拌的方式进行萃取是可行的。在工业生产过程中，搅拌萃取更有利于菊苣酸与乙酸乙酯充分接触，使萃取更加充分，更符合工业化的生产标准。

通过多因素优化菊苣酸的萃取工艺，得最优萃取条件为药液菊苣酸浓度为15 mg·mL-1，药液pH=2，乙酸乙酯用量与药液体积分数比例为1∶1，萃取2次，每次萃取时间为40 min（搅拌15 min、静置25 min）     ，搅拌转速为100 r·min-1。在单因素考察中，菊苣酸的萃取率受药液pH的影响最大，随药液pH的增加，萃取率由99.3 %下降到5.5 %，因此在工业生产中要严格控制药液pH。

孟创鸽[4]用2倍量的正丁醇对菊苣酸进行萃取，在50 ℃的条件下萃取40 min，所用萃取剂属于有毒试剂，安全性低，本实验所用的乙酸乙酯更加符合安全生产標准;吴启林等[5]以萃取率为指标，以pH=3浓度C=2.5 mg·mL-1的药液为原料，用同体积乙酸乙酯萃取4次，萃取率为96.8 %，菊苣酸纯度在20%～30%，相比之下，本工艺萃取药液浓度较高，萃取次数少，节约成本且提高了萃取效率。本工艺方便操作，提高了菊苣酸的纯度与萃取率，为工业化生产提供了理论依据，为后期生产发展奠定了基础。

参考文献：

[1]杜妍，甘春丽，曾庆轩，等.紫锥菊中酚酸类化合物的合成[J].哈尔滨医科大学学报，2017，51（3）：200-205.

[2]李晶，聂斌，武力，等.引种紫锥菊中菊苣酸的定性定量分析[J].药物分析杂志，2011，31（9）：1804-1807.

[3]窦德明，崔树玉，曹永智，等.引种紫锥菊有效成分菊苣酸含量研究[J].中草药，2001（11）：30-31.

[4]孟创鸽.菊苣中菊苣酸的提取纯化及生理活性的研究[D].咸阳：西北农林科技大学，2016.

[5]吴启林，袁其朋，陈养文.紫锥菊中菊苣酸提取纯化工艺研究[J].中草药，2004，35（9）：995-997.

（收稿日期：2021-09-03）