抗病毒治疗后HBV准种动态变化及不同感染下的演变过程

钟抒苡 刘寿荣

1.浙江中医药大学 (浙江 杭州， 310053) 2.杭州市西溪医院

乙型肝炎病毒(HBV)感染仍然是世界范围内的一个主要健康问题，可引起慢性乙型肝炎(CHB)和进行性肝纤维化等肝病，并可能导致肝硬化和肝细胞癌，是慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的主要原因。虽然抗病毒治疗的目标是长期抑制血清HBV DNA，但任何抗病毒治疗的最大问题是耐药性的选择和潜在的交叉耐药性。准种概念的提出，使我们对抗病毒治疗有了一个全新的方向。这对于慢性乙型肝炎患者的长期治疗和患者管理尤为重要。本文就抗病毒治疗后HBV准种动态变化及不同感染下的演变过程作一综述。

1 HBV准种的概念

尽管是一种DNA病毒，HBV使用前基因组RNA作为复制中间体。此外，HBV逆转录酶缺乏校对能力，导致复制过程中发生突变和遗传变异。因此，HBV作为一种病毒种群在体内循环，这种病毒具有一系列基因不同但密切相关的变异，称为准种[1](QS)。HBV的准种特性意味着在特定环境下任何新产生的具有选择性优势的突变都将超越其他变异，成为继经典变异之后的优势准种达尔文进化过程。HBV是一种被包膜的小病毒，部分双链DNA基因组长度约为3.2 kb。最初的研究将基因组划分为4个开放读码框架(ORF)，分别命名为S、C、P、X区，4个ORF中表达的氨基酸长度不同，其生物学功能也不相同。准种概念强调的是同一患者血清中病毒之间的遗传相似性、微小差别、病毒群和动态变化等4个要素对HBV存在状态的认识产生了从单一病毒到病毒群、从静态到动态变化的两次飞跃[2]。

2 抗病毒药物治疗

HBV感染仍然是一个主要的公共卫生负担，约30%的肝硬化和45%的肝细胞癌病例是由HBV感染引起的[3]。病毒和宿主因素在持续HBV感染的建立和维持中都起着重要作用。HBV基因组形成一个稳定的小染色体-共价闭合环状DNA(cccDNA) -在肝细胞的细胞核内或整合到宿主基因组中，从而使感染持续[4]。此外，HBV能够抑制抗病毒免疫反应[5，6]，持续暴露于高载量和高蛋白浓度的HBV可能导致T细胞功能受损或衰竭，导致免疫逃逸[7,8]。有研究表明，抗病毒药物可以抑制HBV复制，延缓疾病进展，改善CHB患者的疾病预后[9,10]。目前批准的慢乙肝抗病毒药物包括免疫调节剂(如PEG-IFN)以及直接作用于病毒复制周期不同靶点的DAA(如NA)。

2.1 乙型肝炎病毒流行株全基因的克隆与序列分析 Liang等[11]从2株慢性乙型病毒性肝炎患者的血清提取DNA，应用L-PCR技术克隆、扩增HBVDNA的全基因组序列，克隆获得的5个HBVDNA全基因序列分别为G376-A6、G683-A1、G683-A2和G683-A3，全基因序列长度分别为3125、3215、3213、3182和3215碱基对(bp)。其中G376-A6、G376-A7来源于同一个患者，G683-A1、G683-A2、G683-A3来源于另一个患者。G376-A6、G683-A2两株病毒在前-S1区存在缺失突变区。其中G683-A2的羧基末端存在缺失突变，来源于不同患者的e核心抗原蛋白质一级结构序列没有显著的差别，但来源于同一个患者的HBV基因序列有着明显的同源性。G376-A6、G683-A2两株病毒存在多聚酶蛋白区的缺失突变，但不在多聚酶蛋白的活性结构区，因此考虑这种形式的突变尚不会影响到多聚酶的活性。G683-A3株病毒的多聚酶在其羧基末端存在较长的缺失突变区，使其多聚酶区结构被破环。5株病毒的X蛋白的一级结构序列比较的结果说明其高度保守。但是相对来讲，X蛋白的羧基末端更为保守，羧基末端序列有一定程度的变异。

2.2 核苷(酸)类似物抗病毒治疗与准种动态变化 临床上目前使用的NA有拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV)、替比夫定(LdT)、恩替卡韦(ETV)、富马酸替诺福韦酯(TDF)、富马酸丙酚替诺福韦片(TAF)。它可以抑制HBV DNA聚合酶活性，抑制HBV复制初始患者治疗，强调选择强效低耐药药物，推荐ETV、TDF、TAF。这些抗病毒药物的使用，使得HBV在机体的环境更为复杂多变，不管是准种优势株还是劣势株都处在不断适应环境而进化着，最终导致病毒对抗病毒药物的敏感性降低[12]。Chen等[13]研究RT区HBV准种的动态变化在LAM期有应答者和无应答者之间表现的模式，用PCR方法鉴定阳性克隆,研究发现LAM治疗前4周准种复杂性和多样性的动态变化与短期抗病毒疗效相关。刘斌等[14]研究ADV抗乙肝病毒治疗对HBV准种变异的影响，采用Pearson相关检验分析HBV DNA水平与准种复杂性和多样性的相关性，发现ADV抗乙型肝炎病毒治疗能使HBV准种变异，其中服用ADV对P区准种变异的数量影响较大，但ADV对其C区的作用效果并不明显。黄文勋等[15]研究经LdT治疗后的慢性乙型肝炎患者的HBV逆转录酶区的准种模式和动态变化，在此研究中，使用离子流测序技术，研究经LdT单药物治疗后的21位CHB患者HBV准种变化，总结揭示了经LdT治疗24周的HBV RT区域准种的动态变化过程，发现了HBV RT区域准种的复杂性和多样性在完全病毒学应答反应组和部分应答/无应答组之间无明显的差别。但由于治疗群体大和治疗时间过长导致药物作用不佳与耐药患者逐渐增多。刘斐等[16]研究ETV抗病毒患者乙型肝炎病毒逆转录区准种动态演变规律，应用巢氏PCR进行扩增，分析各种病毒株所占比例在不断发生变化，野生株在抗病毒之前是绝对优势株，出现病毒学突破时，耐药突变株成为种群中的优势株，在ETV抗病毒药物压力下，CHB患者HBV RT区准种分布处于动态变化中，准种变化与ETV抗病毒药物敏感性以及耐药性密切相关，rtM204I/V+Tl180M+rtT184L是与ETV耐药相关的主要变异模式。HBV准种的动态变化可能与长期耐药和敏感性有关。

2.3 干扰素治疗与准种动态变化 干扰素通过增强免疫细胞功能和促进细胞因子的表达、诱导干扰素刺激基因(ISGs)的产生并经干扰素信号通路编码多种抗病毒蛋白等环节作用于HBV复制、转录等重要生物学过程，从而发挥免疫调节和抗病毒的双重作用[17]。传统的IFN-a和peg-IFN-a已被批准用于治疗CHB。传统的IFN-α治疗慢性乙型肝炎的疗效一般。与常规IFN-α治疗相比，peg-IFN-α治疗的HBeAg血清转化、HBV DNA抑制和生化反应均更高[18]。几项关键的国际多中心随机对照临床试验表明，对于接受pegIFN-α-2α治疗48周(180 mg/周)的HBeAg阳性患者，其HBeAg血清转阴率为32%;基线ALT为2～53 ULN和基线ALT为5～103ULN的患者HBeAg血清转换率分别为44.8%和61.1%;停药后24周，HBsAg血清转换率分别为2.3%～3%。研究还表明，对于HBeAg阳性的CHB患者，peg-IFNα-2b能够产生类似的HBV DNA抑制、HBeAg血清转换率和HBsAg清除率;在停药3年后，HBsAg清除率为11%在接受48周peg-IFN-α-2α治疗的HBeAg阴性CHB患者(60%的亚洲人)中，43%的患者在治疗后24周HBV DNA <2 000 IU/ml,42%在治疗结束后48周;治疗结束后24周，HBsAg清除率为3%，治疗3年后上升至8.7%，治疗5年后进一步上升至12%[19]。也有研究证实延长治疗至2年可以提高有效率[20，21]。Yang等[22]研究35名HBeAg阳性CHB儿童，包括18例HBsAg血清转化者和17例非血清转化者，接受48周Peg-IFN-α-2a治疗。在治疗前和治疗12周和24周采集血清样本。对基础核心启动子/前核(BCP/PC)和S/逆转录酶(S/RT)区域的序列进行下一代测序分析。数据显示，在使用Peg-IFN-α-2a治疗的HBeAg阳性CHB儿童中，基线病毒突变和BCP/PC区域内HBV QS(准物种)多样性的动态变化与HBsAg血清转化密切相关。但从药物经济学的角度来看，由于副作用增加和经济负担加重，现阶段不建议延长治疗。

3 HBV准种在不同感染下的演变过程

3.1 乙型肝炎病毒准种多样性增加与肝纤维化进展相关 Wu等[23]共纳入447例初治HBV感染患者，其中IT患者9例，LC患者104例，HCC患者104例，239例CHB患者根据肝纤维化评分分为F1、F2、F3组，采用实时荧光定量PCR检测HBV DNA水平，扩增了HBV基因pre-S(nt2814-75)、S(nt368-827)、基础核心启动子和preore(BCP/PC,nt1607-2068)和core(nt1996-2455)基因的4个片段，估算不同纤维化阶段宿主体内的病毒核苷酸多样性、突变率和选择压力。发现患者间点突变在BCP/PC区、C1653T/T1753V、A1762T、G1764A、A1846T、G1896A、G1899A差异显著。这些突变的频率随年龄增加而增加，并与晚期肝病相关。具体来说，A1762T和G1764A突变随着患者病情进展而增加，并且这些变异积累到个体患者的大部分病毒准种池中。A1762T/G1764A和G1896A突变通过减少或消除HBeAg的产生，在HBeAg阴性的慢性HBV感染中发挥主要作用。血清HBeAg可能发挥免疫调节作用，而胞浆HBeAg作为炎症免疫反应的靶点[24]。HBeAg阴性变异可能比野生型HBV具有选择性优势，因为在慢性HBV感染期间，表达野生型HBV的肝细胞比仅表达HBcAg的肝细胞更容易受到免疫清除[25]。慢性感染期间的损伤会增加肝细胞的更替，诱导纤维化，并增加肝细胞转化和恶性肿瘤的机会[26]。研究表明，A1762T/G1764A和G1896A突变对慢性HBV感染患者HCC和急性-慢性肝功能衰竭发展的影响[27]。随着年龄的增长，BCP/PC区域的突变也增加，增加了准种的多样性。在HBV中，前s结构域经过了严格的选择，而重叠的间隔域相对宽松，对dN/dS比值高的非同义突变具有明显的耐受性。这可能是因为前s基因与功能相关性较低的间隔域存在大量重叠。因此，前s基因的进化受到基因重叠的影响较小。本研究表明，早期CHB患者的突变比例和频率较高。在免疫选择下，HBV准种多样性随着患者年龄的增加而增加，纤维化也随之进展。早期CHB患者，如IT，可能已经经历了低级别肝炎症的发病机制，导致多年损害后的终末期肝病。因此，慢性HBV感染患者应尽早接受治疗，以抑制病毒的复制和多样性，防止肝病进展，从而防止HCC的发生。

3.2 肝硬化患者血清HBV准种特点分析 张欣欣等[28]将50例未接受抗病毒治疗的HBV感染者纳入研究，分为慢性HBV携带组(ASC,10例)、慢性乙型肝炎组(CHB,30例)和慢性乙型肝炎肝硬化组(LC,10例)。收集患者外周血血清，抽提HBVDNA，PCR扩增RT基因组后克隆、测序。实验结果示慢性HBV感染过程中免疫清除期比免疫耐受期具有更宽的HBC变异谱系，肝硬化患者血清HBV RT区准种复杂度最高，对抗病毒药物的选择有一定参考价值，值得进一步研究。

3.3 乙型病毒肝炎准种及突变位点动态变化与HCC进展的关系 Mei等[29]筛选出研究对象为2010年确定的HCC高危人群，年龄30～65岁，血清乙型肝炎表面抗原阳性6个月以上，随访开始时经超声确认无任何肝病，随机选取1例最终发展为肝癌的患者(A)和1例非癌对照者(B)作为本研究的研究对象。采用巢式PCR方法，用两套引物和两轮PCR扩增HBV X基因区域。采用Reitman-Frankel法检测血清丙氨酸转氨酶，ELISA法检测甲胎蛋白，评估肝损害程度和HCC进展情况。实验结果显示X蛋白的羧基功能域和氨基酸分别转化为蛋氨酸和异亮氨酸(K130M和V131I)。以往的研究表明，这些突变可以减少HBeAg的合成，提高HBVDNA的复制水平，形成HBeAg阴性的慢性HBV感染，最终发展为HCC[30]。nt1630突变是与肝癌相关的另一个重要位点，位于SP1结合位点，以往的研究表明，核心启动子的SP1结合位点对核心RNA和前核心RNA的转录起重要作用，另外，目前报道的肝癌相关突变有C1653T、T1753V、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1773T、C1，G1386M、G1613A、A1727G、T1485、B1499、A1757/T1764/G1766和T1766/A1768可单独或联合作为HCC的预测因子[31-36]。因此，我们可以在肝细胞癌发生前的早期检测到这些突变。然而，Mei等所发现的这些突变位点仅仅是A病例进展的原因，更多关于这些突变的作用和致病机制的证据还需要进一步的样本和实验来验证和阐明。

4 总结与展望

近几十年来，随着新型抗病毒药物的开发，慢性乙型肝炎的治疗取得了显著进展。然而，经济负担和耐药性仍然是中国面临的挑战。许多治疗问题仍不满意或不清楚，需要进一步调查。准种概念在抗病毒领域的应用，以及对病毒机制的日益了解，随着有希望的新药物的研究，未来可能会实现慢性乙型肝炎的治愈。在临床实践中，如何利用多方位预测因子建立个体化治疗策略还有待进一步的研究。