调控PD-1/PD-L1表达影响肝癌进展的分子机制研究进展*

朱金霞 刘光伟 杨培伟

1.河南中医药大学第一临床医学院 (河南 郑州， 450000) 2.河南中医药大学第一附属医院脾胃肝胆科

原发性肝癌分为肝细胞癌(HCC)、胆管细胞癌(ICC)以及混合癌。2020年全球肝癌流行病学显示：肝癌占全球癌症新发4.69%，死亡率占8.34%[1]。HCC的治疗采用手术、介入、放化疗及分子靶向免疫等手段。近年来以程序性死亡蛋白1(PD-1)/ PD-L1为代表的免疫检查点抑制剂治疗HCC在临床中显示出前所未有的疗效，逐渐改变着HCC的治疗格局，为肝癌患者提供了新的抗癌策略[2]。

PD-1是一种重要的免疫抑制分子，结合其配体PD-L1后，在肿瘤免疫逃逸、抑制免疫应答、中枢及外周免疫耐受、自身免疫性疾病中发挥重要作用。研究表明，在HCC治疗上，PD-1/PD-L1抑制剂使诸多患者受益、生存期得到有效延长。影响PD-1/PD-L1表达的因素众多，本文总结了WNT-β-catenin、JAK-STAT、PI3K-AKT、NF-κB等信号通路及microRNA、lncRNA、circ-RNA调控PD-1/PD-L1的表达从而影响肝癌进展，指出干预其上游调节因子：利用既能调控PD-1 / PD-L1表达又能调控细胞增殖的分子提高HCC临床疗效是未来治疗的一大策略。

1 PD-1/PD-L1概述

PD-1在T细胞，单核细胞，B细胞，树突状细胞和肿瘤浸润淋巴细胞等免疫细胞上表达。PD-1/PD-L1通过T细胞介导免疫反应：PD-L1在肿瘤细胞和抗原呈递细胞(APC)上表达，T细胞的PD-1结合PD-L1后导致T细胞功能障碍、乃至衰竭。肿瘤中过表达PD-L1可使自身逃脱细胞毒性T细胞(CD8+)介导的细胞杀伤[3]。一种在活化T细胞和APC上表达的蛋白质-B7-1(CD80)，和肿瘤细胞的PD-L1相互作用，导致效应T细胞活化减少[4]。CD8+T细胞衰竭后，肿瘤细胞的活性增强且侵略性高，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，白介素2(IL-2)和干扰素γ(IFN-γ)等多种促炎细胞因子被分泌，为肿瘤的发生营造出高炎性环境。T细胞的另一种亚型：Treg CD4+，通过维持其表面上PD-1表达而产生高度免疫抑制的肿瘤环境。Treg细胞的PD-1蛋白促进了原始CD4+T细胞向Treg细胞的转化，从而抑制了免疫应答，具体来说是通过抑制mTOR-Akt信号传导的哺乳动物靶标而增加了CD4+T细胞的Treg表达和免疫抑制功能[5]。以上可见，PD-1表达不仅减弱了效应性T细胞的免疫促进作用，还增强了免疫抑制性Treg细胞的抑制作用。

抗肿瘤免疫周期的步骤包括：释放肿瘤抗原，肿瘤抗原呈递，引发和激活，T细胞向肿瘤转运，T细胞浸润，通过T细胞识别肿瘤细胞，以及杀死癌细胞。PD-1/PD-L1，主要通过损害细胞溶解性T细胞的活性而影响免疫力[6]。临床常用的单克隆抗体(mAb)免疫疗法疗效显著，具体机制如图1。抗原呈递细胞(APC)结合从癌细胞释放并呈递抗原(Ag)以激活T细胞，T细胞通过T细胞受体(TCR)与MHC呈递的抗原肽复合物结合提供第一活化信号(TCR激活信号传导途径以与CD86/CD28轴的共同刺激信号一起引起T细胞活化。CTLA-4也与CD86结合，但致使T细胞失活)。PD-1在活化的T细胞上表达，并通过结合APC或肿瘤细胞上的PD-L1抑制免疫反应。因此，特异性阻断单克隆抗体(mAb)介导的PD-1/PD-L1 途径可以增强抗肿瘤免疫力。

2 信号通路调控PD-1/PD-L1表达影响肝癌进展

2.1 Wnt-β-catenin Wnt-β-catenin信号通路在细胞增殖、分化、凋亡等方面作用重大，促进肿瘤恶性转化、肿瘤进展及耐药。诸多证据表明异常的Wnt信号致使肿瘤自身的免疫监测系统紊乱，促进免疫逃逸及多种免疫疗法的耐药性。研究表明：β-catenin激活可促进HCC的免疫逃逸和PD-1治疗的耐药性。小鼠自身MYC(致癌基因)、 p53-/-(抑癌基因)抗原表达的HCC通过上调β-catenin途径逃脱了免疫系统。进一步证明了MYC过表达和β-catenin激活的情况下，免疫监视不起作用。β-catenin激活导致树突状细胞(DC)和抗原特异性T细胞的募集缺陷，并因此导致抗肿瘤免疫应答受损。趋化因子(CC基序)配体5的重新表达，这种趋化因子在鼠和人肿瘤中均受β-catenin激活的驱动而被下调，恢复了免疫监视。最后证明肿瘤抗原的表达是PD-1抑制剂治疗发挥作用的必要条件，对于β-catenin激活的HCC模型均未对PD-1抑制剂发生反应，证明了β-catenin激活增强了实验模型中免疫疗法的耐药性[8]。总的来说，HCC中Wnt-β-catenin的激活，抑制了免疫应答，免疫抑制剂耐药性增加。

2.2 JAK-STAT JAK-STAT信号通路在细胞增殖、分化及免疫炎症反应等方面发挥重要作用，对于HCC，JAK / STAT信号传导被异常激活，其下游靶基因控制肿瘤生长，血管生成，免疫监视，侵袭和转移的功能失调[9]。据报道，JAK/STAT途径可在肿瘤中诱导PD-L1表达，对免疫治疗意义非凡。JAK2抑制剂AG490可抑制PD-L1在蛋白质和mRNA水平上的表达[10]。在HCC治疗中，长期使用吲哚美辛通过JAK/STAT3和TRIF/NF-κB途径促进PD-1和PD-L2的表达，从而抑制HCC中的TNF-α和干扰素(IFN-γ)导致疾病预后不良[11]。另外，成纤维细胞生长因子受体(FGFR)2激活JAK/STAT3信号通路的同时致使体外PD-L1表达增多，肿瘤体积变大。而JAK抑制剂下调JAK/STAT3后肿瘤细胞PD-L1表达被阻断[12]。以上均证实JAK / STAT途径激活上调PD-L1表达，而抑制该通路相应表达减少，免疫监视功能恢复。

2.3 PI3K- AKT 磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)信号通路能控制肿瘤细胞生存、增殖、及转移，阻断免疫抑制途径、增强固有免疫而提高免疫监视控制肿瘤进展[13]。首先发现PI3K-Akt通路调节肿瘤PD-L1的表达是在BRAF抑制剂中加入PI3K抑制剂导致PD-L1表达降低[14]。PI3K-AKT抑制因子：PTEN缺失诱导的肿瘤细胞PD-L1细胞表达增加导致T细胞增殖减少和凋亡增加，而使用AKT抑制剂MK-2206或mTOR抑制PI3K途径会导致PD-L1表达降低[15]。虽然AKT抑制剂能降低PD-L1表达，但其下游效应子mTOR/核糖体蛋白S6却不介导AKT诱导的PD-L1表达[14]。联用PI3Kβ和PD-L1抑制剂可显著增加自发性肿瘤模型和移植瘤模型中的CD4+T和CD8+T细胞浸润，显著抑制了肿瘤生长、提高模型存活率。同时下调PTEN可能导致PI3K/AKT的激活并促进体外PD-L1的表达，但体内PD-L1表达呈动态变化，受多种因素调节如IFN-γ等[16]。反过来，PD-1/PD-L1阻断通过PI3K/Akt/mTOR信号通路挽救了肿瘤中耗尽的CD8+T细胞。PD-1/PD-L1不仅可作为预测性生物标志物，还可以作为一种有效的治疗靶点[17]。以上可看出PI3K- AKT-mTOR通路与PD-1/PD-L1互相作用共同影响肿瘤进展。

2.4 NF-κB 核因子κB(NF-κB)是一类具有多向调节作用的核蛋白因子，此途径激活细胞增殖加快、凋亡被抑制、炎症因子表达增加，且能促进肿瘤的侵袭和转移。PD-L1的表达能被NF-κB或Toll样受体(TLR)诱导。研究发现，NF-κB抑制剂与CTLA-4检查点抑制疗法相结合，可减少肝癌、结肠癌、乳腺癌等细胞系的生长，提示NF-κB抑制作用可能起双重作用：靶向肿瘤细胞的增殖和存活以及免疫检查点抑制剂[18]。PD-1抑制剂联用基于李斯特菌的HCC疫苗时，肿瘤细胞局部T细胞重新活化而恢复免疫监视功能。具体机制是激活肿瘤相关巨噬细胞(TAM)中的NF-κB途径，同时募集p62激活自噬途径，使TAM从M2极化转到M1，这种变化会恢复T细胞活性而发挥PD-1抑制剂的免疫阻断作用[19]。NF-κB能调节TLR诱导的PD-1表达，抑制NF-κB后，脂多糖对初级巨噬细胞表面PD-1的诱导被完全阻断[20]。研究表明PD-1单克隆抗体主要通过CD28共受体发挥作用，该受体通过NF-κB通路恢复信号传导并恢复T细胞增殖和活化[21]。以上可知：NF-κB已被证明可调节PD-L1。但是，有关机制的细节还没有得到很好的证明。

其他信号通路如刺猬(Hh)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在肿瘤增殖、凋亡、侵袭及转移方面亦发挥作用。缺氧诱导PD-L1表达并激活Hh信号传导,抑制Hh信号可下调缺氧条件下肿瘤细胞中PD-L1的表达,并能增强活化淋巴细胞的抗肿瘤作用。据此认为Hh信号抑制剂可作为PD-L1抑制剂有效的分子靶向药物[22]。相反MAPK激活可介导化疗药物相关的免疫逃逸：紫杉醇通过MAPK途径上调肝癌HepG2细胞中PD-L1的表达[23]。顺铂通过MAPK / Erk 信号通路诱导肝癌H22细胞PD-L1过表达[24]。以上证据说明：MAPK激活阻碍细胞死亡，同时上调PD-L1抑制免疫反应，使肿瘤细胞对化疗药物的敏感性降低。

3 非编码RNA调控PD-1/PD-L1表达影响肝癌进展

3.1 MicroRNA调控PD-1/PD-L1表达影响肝癌进展 MicroRNA(miRNA)是一类小的非编码RNA，通过直接结合信使RNA(mRNA)的3'非翻译区(3'UTR)(直接作用)或靶向其他参与调控基因表达的基因(间接作用)来调控基因的表达。近年来证据表明，miRNA在调节宿主免疫反应方面作用巨大[25]。

大多数miRNA通过直接结合3'UTR调节PD-1/PD-L1表达：①直接抑制PD-1蛋白表达：miR-374b可以与PD-1相互作用，并且能影响细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞的肿瘤靶向能力，最终通过体内和体外实验证明：miR-374b通过下调细胞因子诱导的CIK细胞上的PD-1表达来抑制肝癌的进展[26]。miR-570结合PD-1mRNA的3'UTR直接抑制肝癌HepG2细胞PD-1的表达[27]。②抑制PD-L1的转录和翻译:最先被发现的PD-L1调节子是miR-513，结合3'UTR在转录水平上抑制PD-L1表达。miR-513的强制表达抑制IFN-γ诱导的PD-L1表达[28]。③直接降低肝癌细胞PD-L1表达水平：miR-200家族是一类与肿瘤生存进展有关的microRNA，有5种类型：miR-200a/bc、miR-429及miR-141。研究人肝癌组织标本时得出miR-200家族与PD-L1负相关；细胞实验证明肝癌miR-200直接靶向PD-L1产生负调控效应，且肝癌细胞的增殖被明显抑制[29]。miR-200c能阻断PD-L1诱导的T细胞衰竭，并逆转抗病毒CD8+T细胞衰竭[30]。表明miR-200家族可能在肝癌患者免疫检查点抑制剂治疗中起作用，对于HCC临床治疗有一定的指导意义。

miRNAs还可以通过上下游途径间接对PD-1/PD-L1发挥调控作用。miR-23a-3p(来源于内质网应激的HCC的外泌体)，通过PTEN / AKT通路上调巨噬细胞中PD-L1表达[31]。

以上是不同种类的miRNA作为抑癌基因下调PD-1/PD-L1，作为促癌基因的miRNA可上调其表达。miR-802已被证实在HCC患者的肿瘤组织中上调。miR-802通过转录后抑制DNA损伤反应1((REDD1))参与T细胞衰竭，miR-802上调了PD-1的表达[32]，反之，PD-1/PD-L1影响microRNA的表达。研究中发现PD-1敲除小鼠，抗原引发的PD-1敲除细胞在T细胞受体(TCR)识别后上调miR-21的表达(11倍以上)，证实了PD-1是miR-21的负调节剂[33]。

3.2 lncRNA调控PD-1/PD-L1表达影响肝癌进展 长链非编码RNA(lncRNA)：一类长度大于200 nt的非编码RNA，已成为多种疾病(包括肿瘤)基因表达的重要调控子。各种HCC相关的lncRNA已显示出异常表达，并通过与DNA，RNA或蛋白质结合或编码小肽而参与癌性表型(例如持续增殖，逃避凋亡，加速血管形成和侵袭能力的获得)。诸多研究证明：lncRNA表观遗传地调控PD-1/PD-L1表达。

lncRNA可能通过调控PD-L1的表达来协调HCC中的免疫抑制。研究所得：lncRNA PCED1B-AS1通过海绵化hsa-mir-194-5p增强HCC中PD-L1和PD-L2的表达，以及PCED1B-AS1诱导的PD-L1介导的共培养T细胞免疫抑制。此外，肝癌细胞释放含有外泌体的 PCED1B-AS1，它能调节自身PD-L1表达，同时抑制效应性T细胞和巨噬细胞功能进而诱导肝癌免疫抑制。最后，体内和体外实验均证明lncRNA PCED1B-AS1促进了肿瘤的侵袭行为[34]。LncRNA MIAT(心肌梗死相关转录本)可能是一种致癌基因，能促进HCC细胞增殖及侵袭，MIAT敲除后HCC增殖活性降低。MIAT不仅与肿瘤浸润淋巴细胞如CD4+T、细胞CD8+T细胞表达呈正相关，而且与免疫抑制分子如PD-1、PD-L1、CTLA4表达呈正相关[35]。肝细胞癌中长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录本1(LncRNA MALAT-1)敲低会导致PD-L1转录因子的下调，另外敲除长链非编码核糖核酸-X(XIST)后，PD-L1显著升高。这些发现被认为有助于阐明肿瘤抑制物miR-194-5p增强PD-L1表达，PD-L1可以被XIST和MALAT-1介导。然而，尽管miR-155-5p过表达时MALAT-1下调，但PD-L1表达高度丰富，因此MALAT-1在肝癌中PD-L1转录物升高中的作用仍存在疑问[36]。

3.3 circRNA调控PD-1/PD-L1表达影响肝癌进展 环状RNA(circRNA)是一类功能性非编码RNA，通过介导RNA的可变性剪接(AS)，转录的顺式调节以及充当竞争性内源RNA来调节生物过程。许多circRNA在肿瘤的形成、进展、复发和耐药性方面意义重大，近年来，CircRNA介导的PD-1表达对肝癌免疫状态的影响倍受关注。

circMET是一种癌基因，可通过Snail(锌指转录因子)/DPP4(二肽基肽4)/CXCL10(CXC趋化因子配体10)轴驱动HCC的免疫抑制和抗PD-1治疗耐药性。而且，DPP4抑制剂西他列汀可显著改善circMET和Snail含量高的荷瘤小鼠的PD-1抗肿瘤免疫作用[37]。环状RNA环指域1(circUHRF1)主要由HCC细胞分泌，并通过诱导HCC中的NK细胞功能障碍而促进免疫抑制。CircUHRF1可能驱动PD-1抑制剂免疫治疗的耐药性，这无疑为HCC患者的治疗提供潜在的治疗策略[38]。以上为circ-RNA作为促癌基因对PD-1/PD-L1的影响研究，某种抑癌基因的circ-RNA对肝癌免疫状态的影响需要进一步挖掘。

4 小结

本文综述了PD-1/PD-L1在HCC进展中发挥举足轻重的作用，探讨了WNT-β-catenin、JAK/STAT、PI3K/AKT、NF-κB等信号通路以及microRNA、lncRNA、circ-RNA如何影响PD-1/PD-L1表达而影响HCC进展。PD-1/PD-L1免疫抑制剂治疗是肝癌诊治的机遇和挑战，对其上游调节剂的识别可以拓宽我们对开发新型抗肿瘤药物用于癌症免疫治疗的理解。为了进一步提高免疫治疗的精准性，寻找那些既能控制PD-1/PD-L1表达又能控制细胞增殖的分子来提高HCC的临床疗效，需要我们对于影响其表达的转录因子、表观遗传因子及某些信号蛋白进行深入探索，做到多方面、多途径综合治疗，提高HCC患者生存率。