代谢组学在中医药治疗NAFLD中的应用

冯苗苗

上海中医药大学协同创新中心 (上海 浦东， 201203)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)在全球的患病率达25%以上[1]，与肥胖、糖尿病、高脂血症、代谢综合征密切相关[2-5]，是代谢综合征(MS)的主要组成部分，是MS在肝脏中的表现[6]。NAFLD的进展形式，尤其是炎症和纤维化与动脉粥样硬化等心血管疾病密切相关[7-9]。

NAFLD发病机制多与肝脏内部脂质聚积、氧化应激及脂质代谢异常等因素有关[10]。随着研究的深入，发现肠道黏膜通透性降低，导致肠道微生态失调及肝脏代谢功能异常所产生的内源性毒素是NAFLD的主要病因[11]。多种代谢危险因素也会增加NAFLD的风险[12]。

传统中医学中没有脂肪肝病名，中医学中“肝胀” “肝癖” “痰饮” “胁痛”与NAFLD的病位以及主要症状相似。NAFLD虽然病在肝，但与脾、胃、肾关系密切，认为NAFLD的病因病机以饮食不节，脾失运化；情志失调，肝郁气滞；他病迁延，痰湿瘀结以及脏腑虚衰，脾肾内虚为主。根据中医治疗原则，许多古代文献和现代研究都报道了中医药治疗NAFLD[13-16]。

肝脏是机体代谢的枢纽，三大代谢糖类、蛋白质、氨基酸都在肝脏进行，肝脏承担了大部分的合成、分解、转化和排泄等代谢过程，从代谢角度对肝脏疾病进行系统研究非常重要。代谢组学属于系统生物学和组学，是中医药研究的重要工具，是寻找功能性小分子以评估中药作用的一种新方法[17-19]。本文基于近年代谢组学在中医药治疗NAFLD中的应用做一综述，为中医药治疗NAFLD提供更多依据。

1 代谢组学在疾病诊断中的应用

代谢组学已成为许多疾病生物标记物发现的工具，代谢组学技术通过分析内源性代谢物的组成和变化，解释疾病的发病机制，目前已经发现了许多与代谢性疾病相关的生物标志物。Li等运用非靶向代谢组学发现六种代谢物：棕榈酸、亚油酸、4-吡哆酸、磷脂酰甘油(20∶3/2∶0) 、肉碱(14∶1)和β石胆酸与冠心病有很强的相关性[20]。Li等人运用非靶向代谢组学发现五种代谢物(1-萘酚、2-萘酚、甲基衣康酸酯、NAcetyl-D-氨基葡萄糖 6-磷酸和 L-肉碱)有助于将冠心病患者与健康对照分开，这五种代谢物中的两种代谢物被鉴定为用于冠心病诊断的潜在血浆生物标志物[21]。Luo等研究发现苯丙氨酰色氨酸和甘胆酸盐在区分肝癌和肝硬化具有比甲胎蛋白更好的诊断性能[22]。Li J等运用代谢组学分析发现酪氨酸和谷氨酰胺—亮氨酸可作为早期结直肠癌的临床诊断生物标志物[23]。一项芬兰的研究[24]发现代谢物：肌酸、1-棕榈酰甘油酯(16∶1)、脲酸盐、2-聚羟基丁酸酯/2-乳酸乙酯、黄嘌呤、黄尿酸、3-(4-羟基苯基)乳酸、1-油酸甘油酯(18∶1)、1-肉豆蔻酰甘油(14∶0)、2-甲基甘氨酸(水杨酸盐)与糖尿病的发病风险相关。

韩国的一项队列研究发现在调整其他风险因素后肥胖人群中的代谢物精氨、烷基酰磷脂酰胆碱(C34：3，C36：3，C42：1)、羟基鞘磷脂(C22：2，C14：1)、鞘磷脂(C16：0)，这五种物质中除了羟基鞘磷脂(C14：1)和鞘磷脂(C16：0)与瘦型糖尿病发病风险明显相关[25]。

Sun等[26]对T2DM生物标志物进行Meta分析，识别出与T2DM相关的几种代谢物，包括氨基酸、脂类、酰基肉碱和碳水化合物[27]。Guo等[28]结合网络药理学和代谢组学研究表明黄芪-薯蓣药通过调节单胺氧化酶 B(MAOB) 、乙酰辅酶A羧化酶1(ACACA) 、碳酸酐酶2(CA2) 和过氧化氢酶(CAT) 具有降血糖作用。张志军等[29]应用代谢组学研究发现与T2DM相关的代谢物包括乙酸、乳酸、牛磺酸等，得出糖代谢紊乱、氧化应激、氨基酸及脂类代谢异常、维生素缺乏在T2DM及其并发症发生发展中起重要作用。

Satish C Kalhan[30]等对NASH患者的空腹状态血浆进行了代谢组研究，发现NASH患者中循环支链氨基酸、苯丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸水平高于健康人。Lake AD等进一步证实了NASH中循环支链氨基酸是增加的，研究发现在脂肪变性向脂肪性肝炎转变过程中支链氨基酸、酪氨酸和苯丙氨酸水平明显增加[31]。齐素文等运用代谢组学方法鉴定出焦谷氨酸可作为NASH的生物诊断标志物[32]，来自于上海曙光医院的小样本尿液代谢组学研究发现NASH患者中焦谷氨酸的含量高于NAFLD患者[33]。楼燕红[34]运用串联质谱技术，选取了非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及非酒精性脂肪肝(NAFL)患者各30例，发现两者血液中共有30种差异代谢物，最终选出Leu、Ala、Asp、Glu、Orn 5种潜在代谢标志物，具有良好的早期诊断价值。刘晓琳等[35]通过代谢组学发现硬脂酰肉毒碱在NAFLD的不同表型中都稳定升高，为临床提供一个诊断NAFLD的敏感生物标记物。Li等[36]采用胆碱和蛋氨酸缺乏饲料，诱导NAFLD模型，取血清样本分析，选择血糖、谷氨酸/谷氨酰胺、牛磺酸、乳酸作为脂肪肝的生物标志物。

2 代谢组学与中医证候研究

如何实现中医证候的客观化和规范化，已成为中医药推广应用中的一个重要问题。代谢组学所体现的整体性和动态性，与中医的整体观念和证候理论相一致。在证候发生的过程中，机体的内源性代谢产物的种类、浓度和相对比例均发生变化，所以小分子代谢产物的变化可以通过证候变化体现出来。而这些代谢成分可以分泌到血液和尿液中，通过检测不同证候的生物标志物，进一步探索证候的本质。通过代谢组学技术，来确定“中医证候相关代谢谱”，这已成为探索中医证候生物学基础的有效途径。

近年来有不少医家进行了代谢组学与疾病证候的相关研究，董姝[37]研究发现，肝郁脾虚患者尿代谢组学里的核酸、糖、氨基酸、脂肪和维生素等代谢物的含量与正常人有差异。此外，核酸和维生素代谢过程中次黄嘌呤和乳清酸含量的变化最为显著。杨宇峰等[38]研究发现，气滞湿阻证代谢综合征的发生与糖类、脂类以及蛋白质的代谢紊乱有关，这些内源性代谢物可作为代谢综合征中医证候的物质基础。马欣等[39]发现NAFLD患者中，湿热内蕴和肝郁脾虚两种证型的患者在血清代谢组学研究PLS-DA评分图上表现出显著的代谢差异，并且发现糖类、脂类、氨基酸类、胺类化合物类等11种明显的差异代谢物。以此总结出，NAFLD的不同证候有其特定的生物学基础。Dai等[40]运用代谢组学方法研究湿热型NAFLD和慢性乙型肝炎两种疾病患者的血液和尿液代谢物的异同发现两种疾病间发病的分子机制存在共性；并且发现湿热型与非湿热型NAFLD患者的代谢物谱有差异，可区分不同证型NAFLD。研究提示，湿热型NAFLD和慢性乙型肝炎患者的血清及尿的代谢物谱中硫胺、氮、氰基氨基酸和丁酸甲酯等物质的代谢受到抑制，代谢物水平均下调。通过该项研究不仅揭示了两种疾病的相似性，且与“异病同治”吻合。提示可通过监测具有相同证候的两种或两种以上不同疾病的相同代谢物质，找到潜在的证候标志物。黎晓[41]运用代谢组学方法分析了湿热蕴结型、肝郁脾虚型、瘀血阻络型慢性乙型肝炎患者血清代谢谱，筛出184个代谢物及88个临床指标，经统计分析发现ALT、总胆红素、SM(33∶1)在湿热蕴结型、肝郁脾虚型慢性乙型肝炎中存在差异。从分子生物学筛选出可用于慢性乙型肝炎中医辨证分型的代谢物，液相色谱质谱联用的多元统计方法筛选出鉴别慢性乙型肝炎3组中医辨证分型的差异代谢物，为慢性乙型肝炎的中医辨证分型提供思路。NAFLD[42]典型湿热内蕴证和肝郁脾虚证在代谢层面存在显著的差异，湿热内蕴证与肝郁脾虚证间差异代谢物主要涉及糖类代谢物、脂类代谢物、氨基酸代谢物、组胺、维生素代谢物共5类通路；郭孜等[43]基于GC/MS技术的代谢组学方法，测定乙型肝炎肝硬化不同证候(湿热内蕴证、肝肾阴虚证、脾虚湿盛证、血瘀证)患者及健康者的尿液代谢物，结果发现，组间差异明显，各组的共同差异性尿代谢物为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、柠檬酸、琥珀酸等与能量代谢和氨基酸代谢等通路密切相关的代谢物。其中在湿热内蕴证与肝肾阴虚证之间存在支链氨基酸的差异，湿热内蕴证患者与健康者相比，亮氨酸和缬氨酸呈升高趋势，而肝肾阴虚证患者无明显升高。研究表明，乙型肝炎肝硬化患者不同证候间可能具有不同的代谢模式，而亮氨酸和缬氨酸可能作为临床上用来区分湿热内蕴证和肝肾阴虚证的潜在指标之一。范昕建[44]等采用 GC/MS技术对慢性乙型肝炎的肝郁脾虚证、脾胃湿热证患者及健康人的血清进行代谢组学测试分析，研究发现区分两种证型的关键代谢物为甾体代谢相关氨基酸，如tyrosine和Phenylalanine，以及糖酵解相关代谢物Pyruvate、Lactate、脂类等。与脾胃湿热型证相比较，肝郁脾虚证患者甾体相关的代谢体现出甾体代谢通路下调、糖酵解通路下调，而脂类代谢上调的特征。

证候辨别可通过对比NAFLD各个证候血液及尿液内的小分子代谢物质，经过模式识别分析，观察各个证候之间的代谢产物的不同，包括种类及浓度，作为区分中医证候的依据。通过研究不同证候间代谢产物，可以理清各个证候间的关系，可作为NAFLD既病防变的代谢依据。

3 代谢组学应用于中药治疗NAFLD

NAFLD代谢组学的研究，除了用于疾病的早期诊断、早期治疗、中医证候研究外，还可以研究中药及复方提取物治疗NAFLD。目前，从代谢组学角度研究单味药或复方药治疗NAFLD并不多，对有效成分的研究更少。代谢组学技术是探索药物治疗疾病机制的重要手段。中药往往因其多效和多靶点的作用模式，对其与人体的具体作用机制难以阐明。临床代谢组学可通过比较在药物治疗前后患者体内生物标志物的变化，从而评估药物的治疗效果。中药因其多靶点且不良反应相对较小的特点，与西药治疗相比具有一定的优势[45]。

因此，运用代谢组学方法评估单味中药或方剂的治疗效果可为其作用机制的研究提供新思路。Liu X等[46]应用代谢组学对抑郁症患者和对照组的血浆样本进行分析，发现逍遥散可显著逆转抑郁症生物标志物的水平。随后研究者确定了逍遥散发挥抗抑郁作用的四条代谢通路，明确了逍遥散治疗抑郁症的干预机制。

Dong Y等[47]为明确中药桑黄的保肝机制，运用血清UPLC-Q/TOF-MS代谢组学分析发现桑黄主要通过影响FXR/RXR激活途径参与调节包括不饱和脂肪酸生物合成在内的5个肝损伤病理过程，从而阐明桑黄的肝保护作用和潜在靶标。谢慧臣等[48]应用代谢组学分析方法发现延龄草能明显降低NAFLD模型大鼠尿液中的苹果酸、柠檬酸、延胡索酸等6种代谢物的含量，升高丁酸、棕榈酸、花生四烯酸和十六碳烯酸的含量，提示延龄草提取物干预NAFLD的作用机制可能是调节肝细胞能量代谢相关基因的表达，并由此导致的肝脏代谢物酶谱的变化。刘泰驿等的研究结果表明苦荞蛋白缓解脂肪肝的的作用机理与亚油酸代谢、甘油磷脂代谢、鞘脂类代谢、色氨酸代谢、花生四烯酸代谢、糖代谢6条代谢通路相关[49]。张艳等研究发现银耳多糖[50]改善NAFLD主要涉及的代谢通路有酮体的合成和代谢、乙醛和二羧酸代谢、抗坏血酸和醛酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、TCA 循环和丁酸代谢。有研究[51]用 GC-MS 发现白花蛇舌草可以通过调节碳水化合物代谢、脂代谢以及氨基酸代谢等代谢通路对肝损伤进行干预与调节。茵陈蒿汤[52]可改善NAFLD涉及到最强的3个代谢通路分别为甘油磷脂代谢、嘌呤代谢和谷胱甘肽代谢。NASH、NAFL和NAFL+T2DM都出现了脂质和脂肪酸的代谢紊乱，硬脂酰肉毒碱在NAFLD的不同表型中都稳定升高，可以为临床提供一个更敏感的NAFLD诊断标记物[53]。苏赵威等[54]用GC-MS法研究发现当归芍药散加味可能是通过调控代谢紊乱的机制对NAFLD起到治疗作用。Chao J等[55]釆用代谢组学方法发现没食子酸的肝保护作用部分是通过逆转高脂饮食导致的脂质代谢、葡萄糖代谢(糖酵解和糖异生)、氨基酸代谢和胆碱代谢等的紊乱而发生的。Gou XJ等[56]采用GC-MS方法研究祛瘀化浊方对高脂饮食诱导的大鼠脂肪肝具有显著的保护作用，这可能归因于调节P-丙氨酸、丙氨酸、丙酮酸、甘氨酸代谢、天冬氨酸和谷氨酸代谢、丝氨酸和苏氨酸代谢以及改善三羧酸循环的功能障碍。刘霞飞等[57]采用UPLC-MS法探讨正柴胡饮的肝损伤保护作用机制，研究发现正柴胡饮可调节由对乙酰氨基酚引起的内源性代谢物的变化从而对其所致的药源性肝损伤具有保护作用，代谢组学方法能够灵敏、准确地预测肝损伤的发生、发展，为临床合理用药及阐明药物保护作用机制提供了依据。Yang H等[58]采用代谢组学方法研究表明逆转脂肪酸代谢途径是甘草次酸保护对乙酰氨基酚肝毒性的重要机制。Gao D等人[59]采用UPLC-MS的方法研究土茯苓主要通过调节精氨酸和脯氨酸代谢、胆汁酸生物合成和鞘脂代谢三种代谢途径发挥保肝作用。Song YN等[60]基于GC-MS方法研究绞股蓝总皂苷可能通过调节糖酵解以及抑制脂质过氧化从而保护肝纤维化。Hongyang Z等[61]釆用UPLC-TOF-MS法研究茵陈蒿汤的抗纤维化作用可能是由于抑制氧化应激和脂质过氧化所致。研究[62]参苓白术散可能是通过干预肝脏脂代谢、糖代谢和氨基酸代谢途径改善肝脏脂质沉积状态，从而为临床治疗NAFLD提供了较好指导意义。

4 展望

综上研究，代谢组学正处于快速发展阶段，日益成为研究热点。代谢组学技术主要用于生物标志物的发现。肝脏疾病的代谢组学研究是学术界的热点之一，随着肝脏疾病的代谢组学研究进展，我们可以更多的发现对肝脏疾病具有诊断意义的特异性标志物。中药通过调节脂质代谢、氨基酸代谢、肠道微生物代谢和能量代谢，发挥对脂肪肝的干预作用。利用代谢组学技术可识别脂肪肝的早期生物标志物，探索其发病机制，对脂肪肝的诊断及治疗具有一定的参考意义。近来，代谢物变化与肠道菌群的研究已成为代谢组学的一个新方向，后续研究可将代谢组学与其它学科结合，深入探索脂肪肝的发病机制。中医是国粹，应发扬光大。系统生物学及相关技术的发展，为多学科、多视角认识中医药治疗疾病机制提供技术条件。代谢组学与中医药学的结合可以加快中医药研究的进程，并将成为中医药现代研究的一项重要技术。未来，代谢组学有望成为发现中药活性成分和阐明其机制的工具。通过代谢组学对中药治疗疾病机理研究，对临床应用具有重要指导意义。